Qiagen, L6020L, ligasa de ADN T7 (900.000 U)

900.000 U de ADN ligasa T7 (3.000.000 U/ml) y tampón de ligación rápida 2x

Características

- Solo une eficientemente los extremos cohesivos
- Baja eficiencia al unir extremos romos
- Reparar mellas monocatenarias en ADN dúplex

Detalles del producto

La ADN ligasa T7 cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un extremo fosfato 5ʹ y un extremo hidroxilo 3ʹ en el ADN dúplex. La enzima solo une eficazmente los extremos cohesivos y repara las muescas monocatenarias en el ADN dúplex. No es muy eficaz para catalizar la ligadura de extremos romos. Sin embargo, la adición de altas concentraciones de PEG 6000 al ≥ 20 % (p/v) puede estimular la actividad de la ADN ligasa T7 y producir resultados medibles. Generalmente, en condiciones normales de reacción, la ADN ligasa T7 no puede llevar a cabo la ligadura de extremos romos del ADN, lo que la convierte en una opción adecuada para casos donde existen tanto extremos romos como cohesivos del ADN. Aun así, solo es necesario unir los extremos cohesivos.

Esta enzima se suministra en 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA y 50% glicerol; pH 7,5 a 25 °C.

El tampón de ligadura rápida 2x contiene 132 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, 2 mM DTT, 2 mM ATP y 15 % PEG 6000; pH 7,6 a 25 °C.

Actuación

Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 30.000 U
Exonucleasa bicatenaria: 30.000 U
Endonucleasa bicatenaria: 30.000 U
Contaminación por ADN de E. coli: 30.000 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 41.132 Daltons

Principio

La proteína es producida por una cepa de E. coli recombinante que porta el gen de la ADN ligasa T7.

Una unidad se define como la cantidad de ADN ligasa T7 necesaria para ligar el 50% de fragmentos de ADN de 100 ng con extremos cohesivos en 30 minutos a 23 °C.

Procedimiento

- 10 µL de tampón de ligadura rápida 2x (B1010)
- 50 ng de ADN vectorial
- Exceso molar de 3 veces del ADN insertado
- 1 µL de ADN ligasa T7 (L6020L)
- Agua libre de nucleasas hasta 20 µL

Instrucciones de uso

Ligadura de extremos cohesivos del vector cortado y el inserto. Relación molar de ADN recomendada: vector: inserto = 1:3.

1. Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 20 µL (agregue la ligasa al final):

2. Incubar la mezcla de reacción a 25 °C durante 15 a 30 minutos.

3. Deje el producto ligado en hielo y transforme de 1 a 5 µL del producto en 50 µL de células competentes. Alternativamente, el producto de la ligación puede purificarse mediante el método adecuado o almacenarse a –20 °C.

Notas:

1. La ADN ligasa T3 se suministra con tampón de ligación rápida 2x para las reacciones de ligación. Su actividad es muy baja en ausencia de PEG (1).

2. La ADN ligasa T7 no puede ligar fragmentos de ADN de cadena sencilla (1).

3. La inactivación por calor reduce drásticamente la eficiencia de la transformación.

4. En ausencia de agentes de hacinamiento de alta concentración (por ejemplo, 20–30 % PEG 6-8000), la actividad específica de la ADN ligasa T7 se reduce 1000 veces en fragmentos con extremos romos (1–2).

Control de calidad

La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. La enzima se diluyó en tampón de ligación rápida 1x y se añadió a reacciones de 20 µL que contenían fragmentos de ADN bicatenario y tampón de ligación rápida 1x. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a aproximadamente 23 °C, se colocaron en hielo y se analizaron en un gel de agarosa al 1 % teñido con bromuro de etidio.

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Ligadura de clonación
- Adición de enlaces o adaptadores al ADN de doble cadena
- Sellado de nitidez en ADN bicatenario

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias

1. Doherty, A. y otros (1996) J.Biol. Chem 271:11083.

2. Dayal, T. Observaciones no publicadas.