Qiagen, L6030-HC-L, ligasa de ADN T4 (rápida)

240 000 U de ADN ligasa T4 (600 000 U/ml) 2x tampón de ligación rápida y 10x tampón de ADN ligasa T4

Características

- Une eficazmente extremos romos y cohesivos.
- Repara mellas monocatenarias en ADN dúplex, ARN e híbridos ADN:ARN
- Ligasa de elección para flujos de trabajo de secuenciación

Detalles del producto

La ADN ligasa T4 cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato terminal 5' y un grupo hidroxilo 3' del ADN o ARN dúplex. La enzima une eficazmente extremos romos y cohesivos y repara mellas monocatenarias en ADN, ARN o híbridos ADN:ARN dúplex (1). Esta enzima se suministra en 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1 mM de DTT, 0,1 mM de EDTA y 50 % de glicerol: pH 7,5 a 25 °C.

El tampón de ADN ligasa T4 10x contiene 500 mM de Tris-HCl, 100 mM de MgCl2, 50 mM de DTT y 10 mM de ATP; pH 7,6 a 25 °C.

El tampón de ligadura rápida 2x contiene 132 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, 2 mM DTT, 2 mM ATP y 15 % PEG 6000; pH 7,6 a 25 °C.

Actuación

Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 6000 U
Exonucleasa bicatenaria: 6000 U
Endonucleasa bicatenaria: 6000 U
Contaminación por ADN de E. coli: 6000 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 55.292 Daltons

Principio

La proteína enzimática recombinante es producida por una cepa de E. coli recombinante que porta el gen de la ADN ligasa T4 clonado.

Una unidad se define como la cantidad de ADN ligasa T4 necesaria para unir el 50 % de 100 ng de fragmentos de ADN con extremos cohesivos en 50 µL de tampón de ADN ligasa T4 1x después de una incubación de 30 minutos a 23 °C.

Procedimiento

Reactivo: Cantidad
Tampón de ligadura de ADN 10x T4: 2 µL
Vector: Variable
Insertar: Variable
Ligasa de ADN T4 (120 U/µL): 1 µL
Agua tipo I: variable
Volumen total: 20 µaL

Instrucciones de uso

Para la configuración de la reacción para la ligasa de ADN T4 (150 000 U) y la ligasa de ADN T4 (240 000 U).

1. Transfiera todos los componentes de la tabla anterior a un recipiente de reacción limpio y mezcle bien pipeteando. 2. Incube a 25 °C durante 30 minutos. 3. Purifique inmediatamente el ADN con columnas de limpieza para PCR y eluya en aproximadamente 50 µL. 4. Como alternativa, diluya inmediatamente (al menos 1:10, pero asegúrese de disponer de 0,1–10 ng de producto de ligación para la transformación) en TE o agua. 5. Transforme 0,1–10 ng de producto de ligación en una línea celular química o electrocompetente compatible con el vector.

Notas

Una unidad final cohesiva de la ligasa de ADN T4 equivale aproximadamente a 3 unidades finales cohesivas medidas con un sustrato de fragmento de ADN Lambda-Hind III en un tampón de reacción de la ligasa de ADN T4 1x.

Una unidad Weiss equivale aproximadamente a 22 unidades finales cohesivas de la ADN ligasa T4.

La ADN ligasa T4 depende de ATP. Recomendamos desechar el tampón de reacción después de un año de almacenamiento a –20 °C y reemplazarlo con tampón nuevo para garantizar el máximo rendimiento.

Las ligaduras de un solo inserto son óptimas cuando se busca una relación inserto:vector entre 2 y 6. Una relación superior a 6:1 promoverá la inserción de múltiples fragmentos, mientras que una inferior a 2:1 reducirá la eficiencia de la ligadura. En caso de ligaduras problemáticas o si se desconoce la concentración de ADN, puede ser necesario variar las relaciones y realizar múltiples ligaduras. El tampón de ADN ligasa T4 10x no contiene PEG y es compatible con los protocolos de ligadura estándar que no especifican el uso de un tampón de formato rápido.

Mejor: Purifique el producto con una columna de centrifugación para purificación de ADN y elúyalo en 50 µL de TE tras la ligación. El ADN ya está listo para la transformación. La cantidad final de ADN a transformar debe estar entre 0,1 y 10 ng.

Mejor: Diluir el producto de ligación en ddH₂O o TE para reducir la concentración de PEG. La cantidad final de ADN a transformar debe estar entre 0,1 y 10 ng.

La ADN ligasa T4 de alta concentración, en combinación con el tampón de ligadura rápida 2x, aumenta considerablemente la velocidad y la eficiencia de la ligadura de extremos romos; por lo tanto, no se recomiendan incubaciones prolongadas (>10 minutos), ya que pueden reducir significativamente la eficiencia de transformación de los productos de la ligadura. Se recomienda el siguiente protocolo para maximizar la eficiencia de transformación de la combinación correcta de inserto/vector.

El tampón de ligasa de ADN T4 10x no contiene PEG y es compatible con los protocolos de ligadura estándar, que no especifican el uso de un tampón de formato rápido.

Referencia 1. Engler, MJ, y Richardson, CC (1982) PD Boyer (Eds.), The Enzymes , 5, págs. 3. San Diego: Academic Press.

Control de calidad

La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. La enzima se diluyó en tampón de reacción de ADN ligasa T4 1x y se añadió a reacciones de 20 µL que contenían fragmentos de ADN doble y tampón de reacción de ADN ligasa T4 1x. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a 23 °C, se detuvieron y se analizaron en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Clonación de restricción
- Clonación TA
- Ligadura del adaptador
- Construcción y clonación de bibliotecas NGS

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: