Qiagen, L6050L, T4 ARN ligasa 1 (10 000 U)

20 000 U/ml y tampón de ligasa de ARN T4 10X (1 x 1,5 ml)

Características

- Ligadura dependiente de ATP de ARN monocatenario y ADN monocatenario

Detalles del producto

La ARN ligasa T4 cataliza la ligadura dependiente de ATP de ácidos nucleicos monocatenarios (ARN o ADN) uniendo un donante de ácido nucleico terminado en fosforilo 5' a un aceptor de ácido nucleico terminado en hidroxilo 3' mediante la formación de un enlace fosfodiéster 3'→5' (1).

Se suministra en: 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50 % glicerol (pH 7,5 a 25 °C)

Se suministra con: tampón de ligasa de ARN T4 10X (B6050): 500 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, 100 mM DTT (pH 7,8 a 25 °C)

Actuación

Prueba: Cantidad analizada
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 200 U
Exonucleasa bicatenaria: 200 U
Endonucleasa bicatenaria: 200 U
Contaminación por ADN de E. coli: 200 U
Contaminación por ARNasa: 200 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 43,5 kDa

Principio

La enzima es producida por una cepa de E. coli recombinante que lleva el gen de la ARN ligasa T4 del bacteriófago T4.

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para ligar el 50% de 0,4 μg de una mezcla equimolar de dos oligonucleótidos de ARN monocatenarios de 23 bases (uno 5'-fosforilado) en 20 μL de tampón de ligasa de ARN T4 1X después de una incubación de 30 minutos a 37 °C.

Procedimiento

Componentes: Concentración final
Agua libre de nucleasas: N/A
Tampón de ligasa de ARN T4 10X (B6050): 1X
ARN monocatenario con extremos 5'P y 3'OH: 200 ng - 1 µg
Inhibidor de la ARNasa (Y9240): 20 U
T4 ARN Ligasa 1 (L6050L): 10 U
Volumen total =: 20 µL

- Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 20 µL: Componentes Concentración final Volumen Agua libre de nucleasas N/AX µL 10X Tampón de ligasa de ARN T4 (B6050) 1X 2 µL ARN monocatenario con extremos 5'P y 3'OH 200 ng - 1 µg X µL Inhibidor de ARNasa (Y9240) 20 U 0,5 µL Ligasa de ARN T4 1 (L6050L) 10 U 0,5 µL Volumen total = 20 µL
- Incubar a 25°C durante 1—2 horas.
- La reacción se puede detener agregando EDTA a una concentración final de 12,5 mM o limpiando mediante un método basado en columna de centrifugación.

- Para sustratos monocatenarios difíciles de ligar, la eficiencia de ligadura se puede mejorar agregando PEG a una concentración final de 5 a 10%.
- Para sustratos de ARN monocatenario más largos, la incubación durante la noche a 16 °C puede mejorar el rendimiento.

Instrucciones de uso

Circularización de ARN monocatenario

Notas:

Control de calidad

La actividad unitaria se mide mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en tampón de reacción de ARN ligasa T4 1X y se añadieron a reacciones de 20 µL que contenían 0,4 µg de una mezcla equimolar de dos oligonucleótidos de ARN monocatenarios de 23 bases (uno fosforilado en 5′) y tampón de ARN ligasa T4 1X. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a 37 °C, se detuvieron y se analizaron en un gel de TBE-urea al 15% teñido con SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen S-11494). La concentración de proteína (DO 280) se determina por la absorbancia de DO 280. La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones de enzima concentradas y diluidas, seguida de la detección por tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida. La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática, incubada durante 4 horas a 37 °C. La exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática, incubada durante 4 horas a 37 °C. La endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática, incubada durante 4 horas a 37 °C. La contaminación por ADNr 16S de coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática desnaturalizadas y analizadas mediante qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante, utilizando cebadores oligonucleotídicos correspondientes al locus del ARNr 16S. La contaminación por ARNasa no específica se evalúa utilizando el kit RNase Alert (Integrated DNA Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Aplicaciones

- Ligadura de ARN monocatenario y ADN monocatenario
- Marcado de los extremos 3' del ARN

- Silber, R. y otros (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 69(10):300-3013.

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias