Qiagen, L6060L, Taq ADN ligasa (20.000 U)

Taq ADN ligasa (40 000 U/ml) y tampón Taq ADN ligasa 10X

Características

- Ligasa de ADN termoestable
- Sella muescas
- Discrimina contra la ligadura por desajuste

Detalles del producto

La ADN ligasa Taq cataliza la formación de un enlace fosfodiéster en el ADN dúplex que contiene extremos adyacentes de 5'-fosforilo y 3'-hidroxilo, utilizando NAD + como cofactor (1).

Se suministra en: 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Tween-20, 50 % glicerol (pH 7,5 a 25 °C)

Se suministra con: tampón de ADN ligasa Taq 10X (B6060): 200 mM Tris-HCl, 250 mM KCl, 100 mM MgCl2, 5 mM NAD+, 0,1 % Triton X-100 (pH 7,6 a 25 °C)

Actuación

Prueba: Cantidad analizada
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 400 U
Exonucleasa bicatenaria: 400 U
Endonucleasa bicatenaria: 400 U
Contaminación por ADN de E. coli: 400 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 76,9 kDa

Principio

La enzima es producida por una cepa de E. coli recombinante que lleva el gen Taq ADN ligasa clonado.

Una unidad se define como la cantidad de Taq ADN ligasa necesaria para unir el 50 % de 1 µg de los extremos cohesivos de 12 bases del ADN Lambda cortado con SmaI y SalI en 50 µL de tampón de Taq ADN ligasa 1X después de una incubación de 10 minutos a 45 °C.

Procedimiento

Componentes: Concentración final
Agua libre de nucleasas: N/A
Tampón de ADN ligasa Taq 10X (B6060): 1X
ADN: hasta 1 µg
Ligasa de ADN Taq (L6060L): 80 U
Volumen total =: 50 µL

- Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 50 µL: Componentes Concentración final Volumen Agua libre de nucleasas N/AX µL Tampón Taq DNA Ligasa 10X (B6060) 1X 5 µL ADN hasta 1 µg X µL Taq DNA Ligasa (L6060L) 80 U 2 µL Volumen total = 50 µL
- Incubar a 45°C durante 10 minutos.

Instrucciones de uso

Ligadura de Nick en ADN bicatenario

Control de calidad

La actividad unitaria se mide mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones del lote de enzima se realizaron en tampón de reacción de ADN ligasa Taq 1X y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían ADN digerido con λ Hind III y tampón de reacción de ADN ligasa Taq 1X. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 45 °C, se detuvieron y se analizaron en un gel de agarosa al 0,8 % teñido con bromuro de etidio.

La concentración de proteína (OD 280) se determina mediante la absorbancia de OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de la detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación del ADNr 16S de E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Ligadura a alta temperatura
- Reacción en cadena de la ligasa
- Reacción de detección de ligasa

- Takahashi, M. y otros (1984). J. Biol. Chem. 259, 10041-10047.

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias