Qiagen, L6070L, ARN ligasa T4 2 truncada (500 U)

500 U (paquete de evaluación) T4 ARN ligasa 2 truncada (5000 U/ml) y tampón 10X T4 ARN ligasa 2 truncado (1 x 1,5 ml).

Características

- Une específicamente el extremo 5´ preadenilado del ADN o ARN al extremo 3´ del ARN.
- A diferencia de la ligasa de longitud completa, no puede unir el extremo 5' fosforilado del ARN o ADN al extremo 3' del ARN.
- La ligadura no requiere ATP, pero se necesita sustrato preadenilado.
- Minimiza la ligadura de fondo al utilizar únicamente enlaces preadenilados.

Detalles del producto

La ARN ligasa T4 2 truncada cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre un fosfato 5' preadenilado (ADN o ARN) y el hidroxilo 3' del ARN. La enzima truncada solo contiene los primeros 249 aminoácidos de la ARN ligasa T4 2 de longitud completa, lo que hace que la enzima requiera un donante terminal 5' preadenilado y elimina la necesidad de ATP. Debido a que la ARN ligasa T4 2 truncada no puede usar el fosfato 5' del ARN o ADN como donante en la reacción de ligación, es útil para ciertas aplicaciones, como las ligaduras de enlazadores con ADN 5' preadenilado a ARN hidroxilo 3'. Los productos de ligación específicos deseados se mejoran drásticamente con respecto a los productos de ligación de fondo no deseados, lo que hace que la enzima truncada sea superior a la enzima de longitud completa para este uso. Por lo tanto, esta enzima es una excelente opción para la preparación de bibliotecas de ARN para la secuenciación de ARN (1-5).

Se suministra en: 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50 % glicerol (pH 7,5 a 25 °C)

Se suministra con: 10X T4 ARN ligasa 2, tampón truncado (B6070): 500 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 50 mM DTT (pH 7,6 a 25 °C)

Actuación

Prueba: Especificaciones
Pureza SDS: >99%
Actividad específica: 30.000 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: <5,0 % liberada
Exonucleasa bicatenaria: <1,0 % liberada
Endonucleasa bicatenaria: Sin conversión
Contaminación del ADN de E. coli: <10 copias
ARNasa no específica: No se detecta ARNasa no específica

Propiedades: Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C

Principio

Fuente de proteína: Purificada a partir de una cepa de E. coli que expresa el gen T4 ARN ligasa 2 truncado recombinante.

Definición de unidad: 1 unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para ligar el 50 % de 0,4 µg de una mezcla equimolar de un ARN monocatenario de 17 meros marcado con FAM en 5' al extremo 5' preadenilado de un ADN de 18 meros cuando ambos 17 meros se unen a una cadena de ADN complementaria de 35 meros en 20 µL de tampón de reacción 1X después de una incubación de 30 minutos a 37 °C.

Peso molecular: 30.451 Daltons

Procedimiento

Componentes: Concentración final
Agua libre de nucleasas: N/D
10X T4 ARN ligasa 2, tampón de reacción truncado (B6070): 1X
ARN 3' OH: 1 µM
ADN o ARN preadenilado 5': 2 µM
Ligasa de ARN T4 2, truncada (L6070L): 5 U
Volumen total =: 20 µL

- Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 20 µL: Componentes Concentración final Volumen Agua libre de nucleasas N/AX µL 10X T4 ARN ligasa 2, truncada Tampón de reacción (B6070) 1X 2 µL 3' OH ARN 1 µM X µL 5' ADN o ARN preadenilado 2 µM X µL T4 ARN ligasa 2, truncada (L6070L) 5 U 1 µL Volumen total = 20 µL
- Incubar a 37°C durante 30 minutos.
- La reacción se puede detener añadiendo EDTA o incubando a 75°C durante 10 minutos.

Instrucciones de uso: Ligadura del 3' OH del ARN al ADN preadenilado 5'

Análisis de control de calidad: La actividad unitaria se mide mediante un método de dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción 1X y se añadieron 2 µL de cada dilución a reacciones de 18 µL en tampón de reacción 1X que contenían 0,4 µg de una mezcla equimolar de un oligonucleótido de ARN de 17 bases (marcado con FAM en 5') y un oligonucleótido de ADN de 18 bases (preadenilado en 5') anexado a un oligonucleótido de ADN de 35 meros complementario. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a 37 °C, se extinguieron y se analizaron en un gel de TBE-urea al 15 %.

La concentración de proteína (OD 280) se determina mediante la absorbancia de OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de la detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µl que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación del ADNr 16S de E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

La contaminación por ARNasa no específica se evalúa utilizando el kit de alerta de ARNasa (Integrated DNA Technologies), siguiendo las pautas del fabricante.

Aplicaciones

- Construcción de bibliotecas para secuenciación de ARN
- Aumentar la capacidad de identificar miRNAs

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias:

1. Ho, CK y col. (2004) Structure, 12, 327-339. 2. Ho, CK y Shuman, S. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 12709-12714. 3. Nandakumar, J. y col. (2004) J. Biol. Chem, 279, 31337-31347. 4. Aravin, A. y Tusch, T. (2005) FEBS Letters, 579, 5830-5840. 5. Pfeffer, S. y col. (2005) Nat. Meth, 2, 269-276.