Qiagen, L6080L, T4 ARN ligasa 2 (4500 U)

4500 U de T4 ARN ligasa 2 (30 000 U/ml) y tampón de ligadura 10X (1 x 1,5 ml)

Características

- Liga mellas en el ARN bicatenario
- Liga el fosfato 5ʹ y el hidroxilo 3ʹ del ARN

Detalles del producto

La ARN ligasa T4 2 cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre los extremos fosfato 5' e hidroxilo 3' del ARN. El sustrato preferido es el ARN bicatenario mellado, pero también se pueden sellar otros híbridos de ácidos nucleicos mellados. La ARN ligasa T4 2 requiere ATP para su actividad, a menos que el sustrato esté preadenilado en el extremo 5' (1-5).

Se suministra en: 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50 % glicerol (pH 7,5 a 25 °C)

Se suministra con: tampón de ligadura 10X (B6030): 500 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 50 mM DTT, 10 mM ATP (pH 7,6 a 25 °C)

Actuación

Prueba: Cantidad analizada
Pureza: n/a
Actividad específica: 500 U
Exonucleasa monocatenaria: 500 U
Exonucleasa bicatenaria: 500 U
Endonucleasa bicatenaria: 500 U
Contaminación por ADN de E. coli: 500 U
Contaminación por ARNasa: 500 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 37,6 kDa

Principio

La enzima se purifica a partir de una cepa de E. coli que expresa el gen de la ARN ligasa T4 recombinante 2.

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para ligar el 50% de 0,4 µg de una mezcla equimolar de un ARN monocatenario de 17 meros marcado con FAM en 5' al extremo fosforilado en 5' de un ADN de 18 meros cuando ambas hebras se unen a una hebra de ADN complementaria de 35 meros en 20 µL a 37 °C durante 30 minutos.

Procedimiento

Componentes: Concentración final
Agua libre de nucleasas: N/A
Tampón de ligasa de ARN T4 10X (B6030): 1X
Sustrato de dsRNA mellado: 1 µM
T4 ARN Ligasa 2 (L6080L): 10 U
Volumen total =: 20 µL

- Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 20 µL: Componentes Concentración final Volumen Agua libre de nucleasas N/AX µL 10X Tampón de ligasa de ARN T4 (B6030) 1X 2 µL Sustrato de ARN bicatenario mellado 1 µM X µL Ligasa de ARN T4 2 (L6080L) 10 U 0,33 µL Volumen total = 20 µL
- Incubar a 25°C durante 60 minutos.
- La reacción se puede detener agregando EDTA e incubando a 65 °C durante 20 minutos o limpiando utilizando un método basado en columna de centrifugación.

Instrucciones de uso

Ligadura de mellas en ARN bicatenario

Control de calidad

La actividad unitaria se mide mediante un método de dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción 1X y se añadieron 2 µL de cada dilución a reacciones de 18 µL en tampón de reacción 1X que contenían 0,4 µg de una mezcla equimolar de un oligonucleótido de ARN de 17 bases (marcado con FAM en 5') y un oligonucleótido de ADN de 18 bases (fosforilado en 5') anexado a un oligonucleótido de ADN complementario de 35 meros. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a 37 °C, se extinguieron y se analizaron en un gel de TBE-urea al 15 %.

La concentración de proteína (OD 280) se determina mediante la absorbancia de OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de la detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación del ADNr 16S de E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

La contaminación por ARNasa no específica se evalúa utilizando el kit RNase Alert (Integrated DNA Technologies), siguiendo las pautas del fabricante.

Aplicaciones

- Ligadura de mellas en ARN bicatenario
- Ligación del OH 3' del ARN al fosfato 5' del ADN en una construcción de biblioteca de ARN NGS de formato bicatenario (miRNA-seq o mRNA-seq direccional)

- Ho, CK y cols. (2004) Estructura, 12, 327-339.
- Ho, CK y Shuman, S. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 99, 12709-12714.
- Nandakumar, J. et al. (2004) J. Biol. Química, 279, 31337-31347.
- Aravin, A. y Tusch, T. (2005) FEBS Letters, 579, 5830-5840.
- Pfeffer, S. y otros (2005) Nat. Meth., 2, 269-276.

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias