Qiagen, L6090L, ligasa de ADN de E. coli (2500 U)

2500 U de ADN ligasa de E. coli (10 000 U/ml) y tampón de reacción de ADN ligasa de E. coli 10x

Características

- Liga el ADN en las muescas y los extremos cohesivos.
- Requiere NAD+

Detalles del producto

La ADN ligasa de E. coli cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre un fosfato 5' adyacente y un hidroxilo 3' de los extremos del ADN, requiriendo NAD+ y Mg2+ como cofactores. La ligadura del ADN con extremos romos es extremadamente ineficiente en comparación con la ligadura cohesiva de extremos del ADN y el sellado de mellas.

Esta enzima se suministra en 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA y 50% glicerol; pH 7,5 a 25 °C.

El tampón de reacción de la ligasa de ADN de E. coli con una concentración de 10x incluye 300 mM de Tris-HCl, 40 mM de MgCl2, 260 µM de NAD, 10 mM de DTT y 0,5 mg/mL de BSA a un pH de 8,0 y una temperatura de 25 °C.

Actuación

Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 100 U
Exonucleasa bicatenaria: 100 U
Endonucleasa bicatenaria: 100 U
Contaminación por ADN de E. coli: 50 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 73.606 Daltons

Referencia

Lehman IR (1974) Ciencia 186, 790-797.

Principio

La proteína enzimática recombinante se produce mediante un plásmido que contiene el gen que codifica la ADN ligasa de E. coli en E. coli.

Una unidad se define como la cantidad de ADN ligasa de E. coli necesaria para ligar el 50% de fragmentos de ADN de 100 ng con extremos cohesivos en 30 minutos a 25 °C.

Procedimiento

- 2 µL de tampón de ligasa de ADN de E. coli 10x (B6090)
- Hasta 5 µg de ADN
- 1 µL (10 U) Ligasa de ADN de E. coli (L6090L)
- Agua libre de nucleasas hasta 20 µL

Instrucciones de uso

1. Prepare la siguiente mezcla de reacción de sellado de mellas en un volumen total de 20 µL:

2. Incubar la mezcla de reacción a 16°C durante 30 minutos.

3. Detener la reacción mediante inactivación térmica a 65 °C durante 20 minutos.

Control de calidad

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Clonación de ADNc por síntesis de reemplazo

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias

1. Lehman, IR (1974) Ciencia, 186, 790-797.