Qiagen, P7010-LC-L, fragmento Klenow (3'→5' exo–) (baja concentración)

10 000 U de Klenow (3'→5' exo–) (2,0 mL a 5000 U/mL) y tampón azul 10X (1 x 1,5 mL)

Características

- La ADN polimerasa carece de actividades de corrección de pruebas (3'→5') y traducción de mellas (3'→5')
- Mantiene una robusta actividad de la ADN polimerasa 3'→5'
- Se utiliza en reacciones de marcado fluorescente para microarrays.
- Ideal para la cola de dA y dT para la ligadura de adaptadores a fragmentos de ADN para la secuenciación de próxima generación

Detalles del producto

El Fragmento Klenow (3'→5' exo-) es el fragmento grande de la ADN polimerasa I (Fragmento Klenow) que presenta deficiencias en las actividades de nucleasa de corrección de errores (3'→5') y de traducción de mellas (3'→5'). El Fragmento Klenow (3'→5' exo-) es una ADN polimerasa mesófila que presenta una actividad moderada de desplazamiento de cadena durante la síntesis de ADN.

La enzima se suministra en 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50% glicerol pH 7,5 a 25 °C.

La enzima se suministra con tampón azul 10X (B0110) que contiene 500 mM de NaCl, 100 mM de Tris-HCl, 100 mM de MgCl 2 , 10 mM de DTT; pH 7,9 a 25 °C.

Actuación

Ensayo: Especificación
Pureza: >99%
Actividad específica: 10.000 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: 500 U <10 % liberadas
Exonucleasa bicatenaria: 500 U <1% liberadas
Endonucleasa bicatenaria: 500 U = Sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 500 U <10 copias
Actividad de UDG: <20 U/mL

Principio

La ADN polimerasa I es una cadena polipeptídica única compuesta por aproximadamente 930 residuos. Esta holoenzima posee tres actividades: ADN polimerasa dependiente de ADN 5'→3', correctora 3'→5' y exonucleasa 3'→5' (también conocida como endonucleasa de flap).

La actividad exonucleasa 5'→3' de la ADN polimerasa I de E. coli la hace inadecuada para ciertas aplicaciones. Su función principal es eliminar los cebadores de ARN en los extremos 5' del ADN recién sintetizado para que la actividad polimerasa pueda rellenar los huecos resultantes. La actividad nucleasa 3'→5' se utiliza durante la reparación del ADN y es necesaria para aplicaciones enzimáticas como la traducción de mellas. No es recomendable para la secuenciación de ADN ni para otras aplicaciones debido a su capacidad para degradar estructuras de colgajo, ADN monocatenario y bicatenario de los extremos 53'→5' libres. El fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli carece de esta actividad de exonucleasa 5' pero conserva la actividad de polimerasa 5'→3' y la actividad de exonucleasa 3'→5' para la eliminación de nucleótidos precodificantes y la corrección de pruebas.

Así como la actividad exonucleasa 5'→3' de la ADN polimerasa I de E. coli puede ser indeseable, la actividad correctora exonucleasa 3'→5' del Fragmento Klenow también puede ser indeseable en ciertas circunstancias. Este problema se soluciona introduciendo mutaciones que resultan en la enzima del Fragmento Klenow (3'→5' exo-), que conserva la actividad polimerasa 5'→3', pero carece de actividad exonucleasa. Las ADN polimerasas que carecen de una exonucleasa 3'→5' pueden añadir un solo nucleótido no dependiente del molde al extremo 3' de una secuencia (cola), con preferencia por dATP, dependiendo de las condiciones de reacción y el contexto de la secuencia.

Este proceso de dA-tailing (o dT-tailing) del ADN es un paso importante en la ligadura de adaptadores de ADN a fragmentos de ADN. Este procedimiento se utiliza frecuentemente en la preparación de bibliotecas de ADN para la secuenciación de nueva generación. La acción del fragmento Klenow (3'→5' exo-) también se utiliza en algunas reacciones de marcaje fluorescente para microarrays.

Procedimiento

Las instrucciones para usar el fragmento Klenow (3'→5' exo-) se proporcionan en el protocolo del kit correspondiente en los recursos a continuación.

Control de calidad

La actividad unitaria del Fragmento Klenow (3'→5' exo-) se midió mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en una solución de almacenamiento de Klenow (3'→5' exo-) con glicerol (50%) y se añadieron a reacciones de 50 μL que contenían ADN de Timo de Ternera, tampón Azul 1X, 3 H-dTTP y 100 μM de dNTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se sumergieron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).

La concentración de proteína del fragmento Klenow (3'→5' exo-) (OD 280) se determinó mediante la absorbancia de OD 280.

La pureza física del fragmento Klenow (3'→5' exo-) se evaluó mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evaluó comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.

La actividad de la exonucleasa monocatenaria en el fragmento Klenow (3'→5' exo-) se determinó en una reacción de 50 μL que contenía un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática, incubada durante 4 horas a 37 °C. La actividad de la exonucleasa bicatenaria en el fragmento Klenow (3'→5' exo-) se determinó en una reacción de 50 μL que contenía un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática, incubada durante 4 horas a 37 °C. La actividad de la endonucleasa bicatenaria en la enzima del fragmento Klenow (3'→5' exo-) se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 0,5 μg de ADN plasmídico y 10 μL de solución enzimática, incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli del fragmento Klenow (3'→5' exo-) se evaluó utilizando muestras replicadas de 5 μL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores oligonucleotídicos correspondientes al locus del ARNr 16S.

La contaminación del fragmento Klenow (3'→5' exo-) con ADN uracilo glicosilasa (UDG) se evaluó en una reacción de 50 μL que contenía ADN uracilo tritiado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 60 minutos a 37 °C en condiciones estándar de caracterización de la unidad UDG.

Aplicaciones

- Aplicaciones principales Opción probada para el etiquetado de ADN, dA-tailing y dT-tailing para la ligadura de adaptadores de secuenciación de próxima generación
- Opción probada para el etiquetado de ADN
- dA-tailing y dT-tailing para la ligadura de adaptadores de secuenciación de próxima generación
- Otras aplicaciones Secuenciación de ADN didesoxi de plantillas de ADN monocatenario o bicatenario Síntesis de segundas cadenas de ADNc Generación de sondas de ADN monocatenario mediante cebadores aleatorios Mutagénesis de ADN dirigida mediante oligonucleótidos sintéticos
- Secuenciación de ADN didesoxi de plantillas de ADN monocatenario o bicatenario
- Síntesis de la segunda cadena de ADNc
- Generación de sondas de ADN monocatenario utilizando cebadores aleatorios
- Mutagénesis de ADN dirigida utilizando oligonucleótidos sintéticos

- Opción probada para el etiquetado de ADN
- dA-tailing y dT-tailing para la ligadura de adaptadores de secuenciación de próxima generación

- Secuenciación de ADN didesoxi de plantillas de ADN monocatenario o bicatenario
- Síntesis de la segunda cadena de ADNc
- Generación de sondas de ADN monocatenario utilizando cebadores aleatorios
- Mutagénesis de ADN dirigida utilizando oligonucleótidos sintéticos

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: