Qiagen, P7020-LC-L, ADN polimerasa Phi29 (baja concentración)

2000 U de ADN polimerasa Phi29 (0,20 mL a 10 000 U/mL) y tampón de reacción de ADN polimerasa Phi29 10x (1 x 1,5 mL)

Características

- ADN polimerasa altamente procesiva
- Potente actividad de desplazamiento de hebras
- Actividad de la exonucleasa 3'→5' (corrección)

Detalles del producto

La ADN polimerasa Phi29 es responsable de la replicación del fago Phi29 de Bacillus subtilis (1). Esta enzima es una ADN polimerasa altamente procesiva (hasta 70.000 inserciones de bases por unión) con una potente actividad de desplazamiento de cadena (2) y una función exonucleasa de corrección 3ʹ→5ʹ de alta fidelidad (3), lo que la hace ideal para la amplificación isotérmica.

La enzima se suministra en 10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% Tween-20, 0,5% NP-40 y 50% glicerol; pH 7,4 a 25°C.

El tampón de reacción de ADN polimerasa Phi29 10X (n.° de cat. B7020) contiene lo siguiente: 500 mM Tris-HClm, 100 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 40 mM DTT y 100 mM MgCl 2 ; pH 7,5 a 25 °C.

Pregunte por las formulaciones que cumplen con la normativa REACH.

Actuación

Prueba: Especificación
Pureza: >99%
Actividad específica: 83.333 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: funcional
Endonucleasa bicatenaria: 100 U: sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 100 U; 83.333 U/mg

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Actividad exonucleasa: 3'→5'
- Peso molecular: 66.713 Daltons

- Blanco, L., y Salas, M. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:5325.
- Blanco, L., et al. (1989) J. Biol. Química. 264:8935.
- Garmendia, C., et al. (1992) J. Biol. Química. 267:2594.

Propiedades

Referencias

Principio

Fuente de proteína enzimática recombinante La proteína es producida por una cepa de E. coli recombinante que lleva el gen de la ADN polimerasa Phi29 del bacteriófago Phi29.

Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de polimerasa necesaria para convertir 0,5 pmol de dTTP en material insoluble en ácido en 10 minutos a 30 °C.

Procedimiento

Análisis de control de calidad. La actividad unitaria se midió mediante el método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en tampón de reacción de ADN polimerasa Phi29 1x y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían ADN λ Hind III, tampón de reacción de ADN polimerasa Phi29 1x, 3H-dTTP, 0,2 µM de dTTP y 200 µM de dATP, dCTP y dGTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 30 °C, se colocaron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Amplificación isotérmica
- Amplificación del genoma completo (WGA)
- Amplificación de círculo rodante (RCA)
- Amplificación de desplazamiento múltiple (MDA)