Qiagen, P7040L, transcriptasa inversa M-MuLV

100.000 U (paquete de evaluación) de transcriptasa inversa M-MuLV (0,50 ml a 200.000 U/ml) y tampón RT M-MuLV 10X (2 x 1,5 ml)

Características

- OEM de QIAGEN ofrece fabricación a granel de transcriptasa inversa M-MuLV en formulaciones personalizadas
- Polimerasa del virus de la leucemia murina de Moloney
- Dominio funcional de la ARNasa H

Detalles del producto

La transcriptasa inversa M-MuLV es una ADN polimerasa que utiliza ARN como sustrato y no presenta una función de exonucleasa 3ʹ a 5ʹ medible para la corrección de errores. Esta enzima puede sintetizar ADNc mediante la extensión de un cebador de ADN hibridado con un molde de ARN y también puede copiar un molde de ADN monocatenario. El dominio H de la ARNasa puede actuar independientemente de la actividad de la polimerasa. La competencia entre las actividades de la polimerasa y la ARNasa H puede limitar la eficiencia de la síntesis de ADNc. El cebador de ADN o el ADNc incompleto del dúplex en formación pueden servir como sustrato de la ARNasa H.

La enzima se suministra en 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 % NP-40 Alternative y 50 % glicerol; pH 7,6 a 25 °C.

Pregunte por las formulaciones que cumplen con la normativa REACH.

El tampón RT 10x M-MuLV (n.° de cat. B7040) contiene 500 mM Tris-HCl, 750 mM KCl, 30 mM MgCl2 y 100 mM DTT; pH 8,3 a 25 °C.

Actuación

Prueba: Especificación
Pureza: >99%
Actividad específica: 169.000 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: 2000 U <5,0 % liberada
Endonucleasa bicatenaria: 2000 U; <1,0 % liberado
Endonucleasa bicatenaria: 2000 U; sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 2000 U; <10 copias
Contaminación por ARNasa: 2000 U; no se detecta ARNasa no específica

Propiedades

Temperatura de almacenamiento: –25 °C a –15 °C Temperatura de reacción recomendada: por debajo de 42 °C Longitud de transcripción: ADNc hasta 7 kb Peso molecular: 68 100 Daltons

Principio

La fuente de la proteína es una cepa de E. coli recombinante que porta el gen de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney.

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 1 nmol de dTTP en material insoluble en ácido en 10 minutos a 37 °C utilizando poli r(A)/oligo (dT) como sustrato.

Procedimiento

Cantidad: Descripción
1 µL: Solución de dNTP 25 mM (n.° de cat. N2050L)
Variable: 1 a 2 µg de ARN total o 5 a 500 ng de ARNm (poli-A seleccionado)
1 µL: Oligo (dT) 12–18 (50 µg/mL) o cebadores aleatorios (125 µg/mL) o cebador GSP (2 pmol)
Agua libre de nucleasas para llevar el volumen total a 10 µL.

Síntesis de primera cadena

1. Recocido de cebadores: combine lo siguiente en un recipiente de reacción libre de ARNasa:

2. Calentar la reacción durante 5 minutos a 65 °C. Centrifugar brevemente (5 segundos) para extraer el condensado y colocar inmediatamente en hielo. 3. Añadir 1 µL de tampón RT 10x M-MuLV (n.º de cat. B7040) y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 10 µL por reacción. 4. Incubar de la siguiente manera: • Si se utilizan cebadores oligo (dT) o GSP, 2 minutos a 42 °C. • Si se utilizan cebadores aleatorios, 2 minutos a 25 °C. 5. Añadir 1 µL (200 unidades) de transcriptasa inversa M-MuLV (n.º de cat. P7040) y mezclar pipeteando suavemente la muestra. (Nota: si se utilizan cebadores aleatorios, preincubar la reacción a 25 °C durante 10 minutos). 6. Incubar a 42 °C durante 45–60 minutos. 7. Inactive la enzima a 85 °C durante 10 minutos. 8. Almacene los productos a –20 °C o continúe con el siguiente paso.

ANÁLISIS DE CONTROL DE CALIDAD

La actividad unitaria se mide mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizan en tampón RT M-MuLV 1x y se añaden a reacciones de 50 µL que contienen 20 µg/mL de poli r(A) ARN, oligo (dT) ADN, tampón RT 1x, 3H-dTTP y 250 µM de dTTP. Las reacciones se incuban durante 10 minutos a 37 °C, se colocan en hielo y se analizan mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25–A8.26).

La concentración de proteínas se determina utilizando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad II (cat. n.° 500-0002).

La contaminación del ADNr 16S de E. coli se mide en muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

El ensayo de ARNasa no específica utiliza el kit RNase Alert (Integrated DNA Technologies), siguiendo las pautas del fabricante.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.

La actividad de la exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

Aplicaciones

• Síntesis de ADNc • RT-PCR