Product Description
5000 U de ADN polimerasa I (10 000 U/ml) y tampón azul 10x. Temperatura de almacenamiento: de –25 °C a –15 °C.
Características
- Sintetiza ADN en dirección 5′-3′
- Posee actividades de exonucleasa 3′→5′ y 5′→3′
- Permite la traducción de mellas durante la síntesis de ADN
Detalles del producto
La ADN polimerasa I es una ADN polimerasa mesófila que presenta síntesis de ADN 5'-3', además de actividades de exonucleasa 3'→5' y 5'→3'. La combinación de la síntesis de ADN y las características de la nucleasa 5'→3' permite la traducción de mellas durante la síntesis de ADN.
La proteína es producida por una cepa de E. coli recombinante que porta el gen PolA.
La enzima se suministra en 25 mM de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, 1,0 mM de ditiotreitol y 50 % de glicerol, pH 7,4 a 25 °C. Se suministra con un tampón azul 10X (B0110) que contiene: 500 mM de NaCl, 100 mM de Tris-HCl, 100 mM de MgCl₂, 10 mM de DTT, pH 7,9 a 25 °C.
Actuación
Ensayo: Especificación
Pureza: >99%
Actividad específica: 6850 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: funcional
Exonucleasa bicatenaria: funcional
Endonucleasa bicatenaria: 200 U; sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 200 U; <10 copias
Principio
La ADN polimerasa I es una ADN polimerasa dependiente de ADN con actividades inherentes de exonucleasa 3´→ 5´ y 5´→ 3´. La actividad de exonucleasa 5´→ 3´ elimina nucleótidos antes de la cadena de ADN en crecimiento, lo que permite la traducción de mellas.
Procedimiento
Las instrucciones para el uso de la ADN polimerasa I se proporcionan en el protocolo del kit correspondiente en los recursos a continuación.
Control de calidad
La actividad unitaria se midió mediante dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción azul 1X y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían ADN de timo de ternera, tampón de reacción azul 1X, 3H-dTTP y 100 µM de dNTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se sumergieron en hielo y se analizaron mediante precipitación con TCA.
La concentración de proteína se determinó mediante absorbancia OD 280.
La pureza física se evaluó mediante SDS-PAGE cargando 2,0 μL de solución enzimática concentrada en un gel desnaturalizante de Tris-glicina al 4-20% flanqueado por un marcador de peso molecular de amplio rango y 2,0 μL de una dilución 1:100 de la muestra.
La exonucleasa monocatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 15 000 cpm de un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 15 000 cpm de un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de endonucleasa bicatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 1 μg de ADN pBR322 y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La contaminación por E. coli se evaluó utilizando muestras de 5 μL de solución enzimática desnaturalizadas y analizadas en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores para el locus 16S rRNA.
Aplicaciones
- Etiquetado de ADN mediante traducción de nick
- Síntesis de ADNc de segunda cadena
Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:
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