Product Description
2500 U de fragmento Klenow (0,5 mL a 5000 U/mL) y tampón azul 10x (1 x 1,5 mL)
Características
- ADN polimerasa mesófila
- Sin actividad de exonucleasa 5'➞3'
- Mantiene la actividad de exonucleasa 3'➞5' mostrando un desplazamiento moderado de la cadena
Detalles del producto
El Fragmento Klenow es una ADN polimerasa mesófila derivada de la enzima reparadora dependiente de ADN, la Polimerasa I de E. coli. Esta enzima exhibe actividades de síntesis y corrección de ADN (3ʹ→5ʹ) nucleasa y, en ausencia del dominio nucleasa (5ʹ→3ʹ) de la holoenzima, presenta una actividad moderada de desplazamiento de cadena durante la síntesis de ADN. La proteína se expresa como un producto truncado del gen PolA de E. coli.
La enzima se suministra en 100 mM de KPO4, 1,0 mM de DTT, 0,1 mM de EDTA y 50% de glicerol; pH 7,4 a 25 °C.
La solución tampón conocida como 10x Blue Buffer tiene un pH de 7,9 a 25 °C e incluye 500 mM de NaCl, 100 mM de Tris-HCl, 100 mM de MgCl 2 y 10 mM de DTT.
Actuación
Prueba: Especificación
Pureza: >99%
Actividad específica: 5000 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: 50 U; funcional
Exonucleasa bicatenaria: 50 U; funcional
Endonucleasa bicatenaria: 50 U; sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 50 U; <10 copias
- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 68,202 Daltons
Principio
La proteína es producida por una cepa de E. coli recombinante que lleva el gen del fragmento Klenow.
Una unidad se define como la cantidad de polimerasa necesaria para convertir 10 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 37 °C.
Procedimiento
- Disolver el ADN en 1x tampón azul (B0110)
- Añadir dNTP (cada uno a una concentración final de 33 µM)
- Añadir 1 U de Fragmento Klenow por microgramo de ADN
Instrucciones de uso
1. Prepare la siguiente mezcla de reacción:
2. Incubar la mezcla de reacción a 25°C durante 15 minutos.
3. Detenga la reacción agregando EDTA (concentración final de 10 mM) y calentando a 75 °C durante 20 minutos.
Control de calidad
La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en una solución de almacenamiento de glicerol Klenow (3ʹ→5ʹ exo–) al 50 % y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían ADN de timo de ternera, tampón de reacción Klenow 1x, 3H-dTTP y 100 µM de dNTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se colocaron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russel (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).
La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.
La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.
La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.
Aplicaciones
- Cola para secuenciación de próxima generación
- Amplificación por desplazamiento de hebra
- Etiquetado de ADN
- Eliminación de voladizos de 3' y relleno de voladizos de 5'
-Jacobsen, H. et al. (1974) Eur. J. Biochem., 45, 623-627.
- Sambrook, J. y Russell, DW (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Clonación molecular: un manual de laboratorio, v3, A8.25-A8.26.
- Sambrook, J. et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Clonación molecular: un manual de laboratorio, (2.ª ed.), 5.40-5.43.
Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:
Referencias
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