Qiagen, P7070L, Desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (6000 U)

6000 U de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (0,30 mL a 20 000 U/mL) y tampón verde 10x (1 x 1,5 mL) y cloruro de cobalto 2,5 mM (1 x 1,5 mL)

Características

- Extiende de manera eficiente ADN y ARN monocatenarios, romos y salientes de 5'.
- Útil para etiquetado de 3'
- Incorpora dATP y dTTP con una eficiencia cinco veces mayor que dCTP y dGTP

Detalles del producto

La desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) es una ADN polimerasa independiente de la plantilla que cataliza la adición de desoxinucleótidos al extremo hidroxilo 3' de moléculas de ADN monocatenario o bicatenario. La presencia de 1 mM de Co₂₂ estimula la formación de colas en los extremos 3' de los fragmentos de ADN (1,2).

Se suministra en: 50 mM KPO 4 , 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glicerol (pH 7,3 a 25 °C) Se suministra con: Tampón verde 10X (B0120): 200 mM Tris-acetato, 500 mM acetato de potasio, 100 mM acetato de magnesio (pH 7,9 a 25 °C) B0220: 2,5 mM CoCl 2

Actuación

Prueba: Cantidad analizada
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 200 U
Exonucleasa bicatenaria: 200 U
Endonucleasa bicatenaria: 200 U
Contaminación por ADN de E. coli: 200 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 82,6 kDa

Principio

La proteína es producida por una cepa de E. coli que transporta el gen de la transferasa terminal clonado del timo de ternera con una etiqueta de fusión N-terminal.

Una unidad se define como la cantidad de polimerasa necesaria para convertir 1 nmol de dTTP en material insoluble en ácido en 1 hora a 37 °C.

Procedimiento

Componentes: Concentración final
Agua tipo I: N/A
Tampón verde 10X (B0120): 1X
2,5 mM de CoCl2 (B0220): 250 µM
10 pmol de extremos de ADN (10-100 ng): 1-10 ng/μL
Mezcla de dNTP: 200 µM
TdT (P7070L): 0,4 U/µL
Volumen total =: 50 µL

- Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 50 µL: Componentes Concentración final Volumen Tipo I Agua N/AX µL Tampón verde 10X (B0120) 1X 5 µL 2,5 mM CoCl 2 (B0220) 250 µM 5 µL 10 pmol Extremos de ADN (10-100 ng) 1-10 ng/µL X µL Mezcla de dNTP 200 µM X µL TdT (P7070L) 0,4 U/µL 1 µL Volumen total = 50 µL
- Incubar a 37°C durante 1 hora.
- Inactivar TdT y detener la reacción calentando a 70°C durante 10 minutos.

Instrucciones de uso

Adición sin plantilla de dNTP a los extremos 3' del ADN

Notas: El Co₂₆ aumenta la eficiencia de incorporación de nucleótidos de las pirimidinas en los extremos romos y cóncavos. Sin embargo, la adición de dNTP a los extremos sobresalientes es más eficiente que con los extremos cóncavos o romos. La TdT requiere un grupo hidroxilo 3' libre para realizar una adición de nucleótidos sin plantilla.

Con una eficiencia limitada, TdT incorporará ribonucleótidos, biotinas y didesoxinucleótidos en presencia de Co 2+ .

Control de calidad

La actividad unitaria se mide mediante un método de dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción 1X y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían ADN de 20 meros Oligo dT, tampón de reacción 1X, 0,25 mM de CoCl₂₃H-dTTP y 100 µM de dTTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se sumergieron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (3).

La concentración de proteína (OD 280) se determina mediante la absorbancia de OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida. La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática, incubada durante 4 horas a 37 °C. La exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática, incubada durante 4 horas a 37 °C. La endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C. La contaminación por ADNr 16S de E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores oligonucleotídicos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Marcaje de extremos 3ʹ con nucleótidos modificados
- Adición de una cola homopolimérica a los extremos del ADN 3'-OH
- Marcaje de extremos romos de roturas de dsADN (ensayo TUNEL)

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias

1. Deng, GR y Wu, R. (1983) Meth. Enzymol., 100:96-116. 2. Roychoudhury, R. et al. (1976) Nucl. Acids Res., 3,101-116. 3. Sambrook, J. et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Molecular Cloning: A Laboratory Manual., (2.ª ed.), 5.40-5.43.