Qiagen, P7080L, ADN polimerasa T4 (exo) (2000 U)

2000 U de ADN polimerasa T4 (3000 U/mL) y tampón azul 10x. Temperatura de almacenamiento: de –25 °C a –15 °C.

Características

- Exhibe una actividad de polimerasa, que cataliza la síntesis de ADN desde el extremo 5' al 3'.
- Exhibe una potente actividad exonucleasa 3′→5′, la llamada función de corrección de pruebas.
- Carece de funciones de exonucleasa 5′→3′ o de desplazamiento de cadena

Detalles del producto

La ADN polimerasa T4 cataliza la extensión de una plantilla de ADN cebada en la dirección 5′→3′. Esta enzima exhibe una potente actividad exonucleasa 3′→5′, pero carece de funciones exonucleasas 5′→3′ o de desplazamiento de cadena.

La proteína es producida por una cepa de E. coli recombinante que porta el gen de la ADN polimerasa T4.

La enzima se suministra en 100 mM de KPO₄, 1 mM de DTT, 0,1 mM de EDTA, 50 % de glicerol, pH 6,5 a 25 °C. Se suministra con un tampón azul 10X (B0110) que contiene: 500 mM de NaCl, 100 mM de Tris-HCl, 100 mM de MgCl₂, 10 mM de DTT, pH 7,9 a 25 °C.

Actuación

Ensayo: Especificación
Pureza: >99%
Actividad específica: 5555 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: funcional
Exonucleasa bicatenaria: funcional
Endonucleasa bicatenaria: 30 U; sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 30 U; <10 copias

Principio

La ADN polimerasa T4 posee dos actividades enzimáticas: una actividad polimerasa, que cataliza la síntesis de ADN desde el extremo 5' al 3', y una actividad exonucleasa 3'→5', denominada función de corrección, que permite reconocer la incorporación de un nucleótido inapropiado y eliminarlo del ADN. A diferencia de la ADN polimerasa I de E. coli, carece de la actividad exonucleasa 5'→3'. La ADN polimerasa T4 siempre utiliza una cadena sencilla de ADN ya existente como molde y requiere un cebador para la síntesis de una nueva cadena complementaria.

Procedimiento

Las instrucciones para el uso de la ADN polimerasa T4 se proporcionan en el protocolo del kit correspondiente en los recursos a continuación.

Control de calidad

La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción 1X y se añadieron a reacciones de 50 μL que contenían ADN de timo de ternera, tampón azul 1X, 3H-dTTP y 100 μM de dNTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se sumergieron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).

La concentración de proteína se determinó mediante absorbancia OD 280.

La pureza física se evaluó mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La endonucleasa bicatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 0,5 μg de ADN plasmídico y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evaluó utilizando muestras replicadas de 5 μL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores oligonucleotídicos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Hacer extremos romos para voladizos de 5' o 3'
- Subclonación por deleción de cadena única
- Síntesis de segunda cadena en mutagénesis dirigida al sitio
- Marcado de sondas mediante síntesis de reemplazo

La ADN polimerasa T4 está disponible para las siguientes aplicaciones: