Qiagen, P7140-LC-L, Manta 1.0 ADN polimerasa (baja concentración)

100.000 U (paquete de evaluación) de ADN polimerasa Manta 1.0 (2,5 mL a 40.000 U/mL) y tampón PCR II 10x (5 x 1,5 mL)

Características

- ADN polimerasa termoestable (Bst)
- Fuerte actividad de desplazamiento de hebras
- Sin actividad de exonucleasa 5'→3' y actividad de exonucleasa 3'→5'

Detalles del producto

La ADN polimerasa Manta 1.0 es una ADN polimerasa termoestable de Bacillus (Bst) que presenta un fuerte desplazamiento de cadena. Esta polimerasa presenta deficiencias en las actividades de nucleasa de corrección de errores (3ʹ→ 5ʹ) y de traducción de mellas (5ʹ→ 3ʹ). La proteína fue caracterizada originalmente y su estructura cristalina fue resuelta por Lorena Beese (1).

Se suministra en: 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1,0 mM de DTT, 0,1 mM de EDTA, <0,1 % de Triton X-100 y 50 % de glicerol; pH 7,5 a 25 °C. Se suministra con: Tampón PCR II 10X (n.º de cat. B7140) que contiene 200 mM de Tris-HCl, 100 mM de (NH₄)₂SO₄, 100 mM de KCl, 20 mM de MgSO₄ y 1,0 % de Triton X-100; pH 8,8 a 25 °C.

Pregunte por formulaciones con bajo contenido de glicerol.

Actuación

Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 4000 U
Exonucleasa bicatenaria: 4000 U
Endonucleasa bicatenaria: 4000 U
Contaminación por ADN de E. coli: 4000 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C

Propiedades de la polimerasa

Principio

Fuente de proteína enzimática recombinante: La proteína es producida por una cepa de E. coli recombinante que lleva el gen de la ADN polimerasa (exo-) polimerasa Manta 1.0.

Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de polimerasa necesaria para convertir 10 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 65 °C.

Peso molecular: 66.215 Daltons

Procedimiento

Instrucciones de uso:

La ADN polimerasa Manta 1.0 exhibe una fuerte actividad de desplazamiento de cadena y se puede utilizar en varios métodos de amplificación de ácidos nucleicos, como amplificaciones isotérmicas, de genoma completo y de desplazamiento múltiple.

Condiciones de reacción

La temperatura de reacción óptima está entre 60-65°C.

El tampón de reacción 10X contiene 2 mM de MgSO₄ a 1X. No contiene dNTP.

Para optimizar, agregue MgSO 4 hasta 10 mM y Manta 1.0 Polimerasa hasta 1,6 U/µL.

Análisis de control de calidad

La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. Se realizaron diluciones del lote de enzima en tampón de reacción 1X y se añadieron a reacciones de 50 µl que contenían ADN de timo de ternera, tampón PCR II 1X, 3H-dTTP y 100 µM de dNTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 65 °C, se colocaron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (2).

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µl que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µl de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µl que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µl de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µl que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µl de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación del ADNr 16S de E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µl de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Amplificación isotérmica
- Amplificación del genoma completo (WGA)
- Amplificación de desplazamiento múltiple (MDA)

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias: 1. Kiefer, et al. Structure 15 de enero de 1997. 5, 95-108. 2. Sambrook, J. et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Molecular Cloning: A Laboratory Manual., (2.ª ed.), 5.40-5.43.