Qiagen, P7180L, ARN polimerasa T7 (50.000 U)

50.000 U/ml de ARN polimerasa T7 y tampón de ARN polimerasa T7 10X

Características

- ARN polimerasa dependiente de ADN
- Alta especificidad para el promotor T7
- Cataliza la síntesis de ARN dependiente de Mg 2+ a partir de rNTP.

Detalles del producto

La ARN polimerasa T7 sintetiza ARN 5ʹ→ 3ʹ a partir de un molde de ADN. La ARN polimerasa T7 requiere su promotor de ADN bicatenario T7 para iniciar la transcripción, pero puede transcribir ARN a partir de moldes de ADN monocatenario y bicatenario. La enzima se suministra en 50 mM de Tris-HCl, 100 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 0,1 mM de EDTA, 50 % de glicerol y <0,1 % de Triton X-100; pH 7,9 a 25 °C.

El tampón de ARN polimerasa T7 10X (B7180) contiene 400 mM de Tris-HCl, 60 mM de MgCl 2 , 100 mM de DTT y 20 mM de espermidina; pH 7,9 a 25 °C.

Actuación

Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 500 U
Exonucleasa bicatenaria: 500 U
Endonucleasa bicatenaria: 500 U
Contaminación por ADN de E. coli: 500 U
Contaminación del ADN por ARNasa: 500 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 98.855 Daltons

Principio

La proteína enzimática recombinante es producida por una cepa recombinante de E. coli que porta el gen de la ARN polimerasa T7. Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 1 nmol de ATP en material precipitable en ácido en una hora a 37 °C.

Procedimiento

Componentes: Concentración final
Agua libre de nucleasas: N/D
Tampón de reacción 10X (B7180): 1X
rNTP: 500 µM cada uno
ADN plantilla: 0,2-1 µg
ARN polimerasa T7 (P7180L): 100 U

- Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 20 μL:

Instrucciones de uso

Síntesis de ARN no marcado

2. Incubar la mezcla de reacción a 37°C durante 1 hora.

Referencias: 1. Chamberlin, M. et al. (1973) J. Biol. Chem., 248, 2235-2244, 2245-2250. 2. Chamberlin, M. et al. (1982) en The Enzymes, 3.ª edición, ed. PD Boyer (Academic Press, Nueva York), 15, 87-108. 3. Sambrook, J. et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Molecular Cloning: A Laboratory Manual., (2.ª ed.), 5.40-5.43.

Control de calidad

La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en una solución de almacenamiento de ARN polimerasa T7 con glicerol al 50 % y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían ADN plasmídico con promotor T7, tampón de ARN polimerasa T7 1X, 3H-ATP y 400 µM de ATP, GTP, CTP y UTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se colocaron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

La contaminación por ARNasa no específica se evalúa utilizando el kit RNAse Alert (Integrated DNA Technologies), siguiendo las pautas del fabricante.

Aplicaciones

- Síntesis de ARN a partir de una plantilla de ADN
- Preparación de la sonda de ARN
- Terapéutica de ARNm

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: