Qiagen, P7260L, ADN polimerasa T7 (3500 U)

3500 U de ADN polimerasa T7 (0,35 mL a 10 000 U/mL) y tampón de ADN polimerasa T7 10X (1 x 1,5 mL)

Características

- Potente actividad exonucleasa 3′→5′ que actúa tanto sobre ADN monocatenario como bicatenario.
- ADN polimerasa mesófila, altamente procesiva y replicativa

Detalles del producto

La ADN polimerasa T7 es la ADN polimerasa mesófila, altamente procesiva y replicativa del bacteriófago T7, responsable de la replicación rápida y precisa del genoma del virus durante su ciclo de infección. La ADN polimerasa T7 es una proteína de dos subunidades, compuesta por un dominio polimerasa (gen 5 del bacteriófago T7) y un factor de procesividad (tiorredoxina del gen trxA de E. coli) (1,2). Esta enzima posee una potente actividad exonucleasa (3′→5′) que actúa sobre el ADN monocatenario y bicatenario, y parece ser responsable de su alta fidelidad y de la prevención de la síntesis por desplazamiento de hebra (3,4,5).

La ADN polimerasa T7 es una ADN polimerasa altamente procesiva con una síntesis y una fidelidad de replicación excepcionalmente altas. La enzima se suministra en 50 mM de KPO₄, 0,1 mM de EDTA, 1,0 mM de DTT y 50 % de glicerol; pH 7,0 a 25 °C.

El tampón de ADN polimerasa T7 10X (B7260) contiene 400 mM Tris-HCl, 200 mM MgCl2 y 500 mM NaCl; pH 7,5 a 25 °C.

Actuación

Prueba: Especificación
Pureza: >99%
Actividad específica: 13.333 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: funcional
Exonucleasa bicatenaria: funcional
Endonucleasa bicatenaria: 100 U, sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 100 U, <10 copias

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 92.140 Daltons

Principio

La proteína enzimática recombinante es producida por una cepa de E. coli recombinante que porta el gen 5 del bacteriófago T7.

Una unidad se define como la cantidad de polimerasa necesaria para convertir 10 nmol de dNTP totales en material insoluble en ácido en 30 minutos a 37 °C.

Procedimiento

Componentes: Concentración final
Agua libre de nucleasas: N/D
Pre-recocido/plantilla: complejo de 20 nmol
Tampón de polimerización de ADN 10X (B7260): 1X
Solución de dNTP de 25 mM: 300 µM
ADN polimerasa T7 (P7260L): 500 U/mL
Volumen total =: 40 µL

- En un recipiente de reacción estéril, combine los siguientes componentes:

Instrucciones de uso

El siguiente flujo de trabajo se puede aplicar a la síntesis de una segunda cadena después de la síntesis de una primera cadena a partir de una plantilla de ARN, o a un experimento de mutagénesis dirigida al sitio donde el cebador mutagénico se extiende de tal manera que se copia toda la cadena de plantilla.

2. Incubar durante 60 minutos a 37 °C. Incubar durante 10 minutos a 70 °C para detener la reacción.

Nota: Esta enzima no es adecuada para la secuenciación de ADN.

Control de calidad

La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en tampón de reacción 1X y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían ADN de timo de ternera, tampón de caracterización de la unidad de ADN polimerasa T7 1X (Tris-HCl 20 mM, KCl 100 mM, MgCl₂ 6 mM, EDTA 0,1 mM, β-mercaptoetanol 5 mM), 3H-dTTP y 150 µM de dNTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se colocaron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Copiar tramos largos
- Manipulación del ADN
- Mutagénesis dirigida al sitio
- Síntesis de segunda cadena
- Reacción de llenado de huecos (sin desplazamiento de hebras)
- Ensayo ISEL: detección de apoptosis mediante marcaje in situ de roturas de ADN

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias

1. Grippo, P., et al. (1971) J. Biol. Química. 246:6867. 2. Modrich, P., et al. (1975) J. Biol. Química. 250:5515. 3. Adler, S., et al. (1979) J. Biol. Química. 254:11605. 4. Hori, K., et al. (1979) J. Biol. Química. 254:11598. 5. Lechner, RL. et al. (1983) J. Biol. Química. 258:11185.