Product Description
1000 U de poli(A) polimerasa (5000 U/mL) y tampón de reacción de poli(A) polimerasa 10x.
Características
- Cataliza la adición de AMP desde ATP al hidroxilo 3' del ARN.
Detalles del producto
La poli(A) polimerasa une ATP (catalizado a partir de AMP) al hidroxilo 3ʹ del ARN, lo que es útil para producir ARN con cola de poli(A).
La enzima se suministra en 25 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 0,1 mM DTT, 0,1 mM EDTA y 50% glicerol; pH 8,0 a 25 °C.
El tampón de reacción para la poli(A) polimerasa a una concentración de 10x incluye 500 mM de Tris-HCl, 2,5 M de NaCl y 100 mM de MgCl 2 , con un pH de 7,9 a 25 °C.
Actuación
Prueba: Unidades probadas
Pureza: >95%
Actividad específica: >20.000 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: 200 U
Exonucleasa bicatenaria: 200 U
Endonucleasa bicatenaria: 200 U
Contaminación por ADN de E. coli: 100 U
Contaminación por ARNasa: 200 U
- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 53.870 Daltons
La poli(A) polimerasa cataliza la adición de AMP desde ATP al hidroxilo 3ʹ del ARN. La reacción requiere Mg₂₄ y es independiente de la plantilla.
Principio
La proteína es producida por una cepa de E. coli que expresa el gen de la polimerasa poli(A) a partir de un plásmido.
Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 1 nmol de ATP en material insoluble en ácido en 10 minutos a 37 °C.
Procedimiento
- 1-10 µg de ARN purificado en 15 µL de agua libre de nucleasas
- 2 µL de tampón de reacción de polimerasa 10x Poly(A) (B7460)
- 2 µL 10 mM de ATP (N2070-10)
- 1 µL de poli(A) polimerasa (P7460L)
Instrucciones de uso
1. Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 20 µL en el orden indicado:
2. Incubar la mezcla de reacción a 37°C durante 30 minutos.
3. Detenga la reacción agregando EDTA (concentración final de 10 mM) o proceda al paso de limpieza.
Control de calidad
La actividad específica se midió mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en un tampón de reacción 1x (Tris-HCl 50 mM, NaCl 250 mM, MgCl₂ 10 mM, pH 7,9 a 25 °C) y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían un oligonucleótido de ARN de 15 meros, tampón de reacción 1x, ATP 1 mM, MnCl₂ 2,5 mM y 3H-ATP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se colocaron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).
La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.
La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.
La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.
La contaminación por ARNasa no específica se evalúa utilizando el kit RNAse Alert (Integrated DNA Technologies), siguiendo las pautas del fabricante.
Aplicaciones
- Fabricación de ARN con cola de poliA
- Marcado de ARN en el extremo 3'
- Terapéutica de ARNm
- Cao, GJ y Sarkar, N. (1992) PNAS, 89, 10380-10384.
- Sambrook, J. y Russell, DW (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Clonación molecular: un manual de laboratorio, v3, A8.25-A8.26.
Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:
Referencias
Order Guidelines
1. Price & Stock Available on Request. Click to send email to: service@iright.com
2. Please DO NOT make payment before confirmation.
3. Minimum order value of $1,000 USD required.
Collaboration
Tony Tang
Email: Tony.Tang@iright.com
Mobile/WhatsApp/Wechat: +86-17717886924