Qiagen, P7511L, ADN polimerasa de alta fidelidad VeraSeq 2.0 (500 U)

500 U de ADN polimerasa de alta fidelidad VeraSeq 2.0 (0,25 mL a 2000 U/mL) con tampón VeraSeq II 5x (6 x 1,5 mL) y tampón VeraSeq GC 5x (3 x 1,5 mL)

Características

- 50 veces mayor fidelidad que la ADN polimerasa Taq
- Se extiende 1 kb en 15 segundos
- Fuerte actividad de corrección (actividad de exonucleasa 3'→5')
- Funciones en concentraciones de Mg 2 + 1,5 a 3,0 mM
- La asociación estratégica y OEM de QIAGEN ofrece fabricación a granel personalizada de esta enzima, incluidas formulaciones con bajo contenido de glicerol y de inicio en caliente.

Detalles del producto

La ADN polimerasa de alta fidelidad VeraSeq™ 2.0 es una polimerasa ultratermoestable diseñada que ofrece velocidad, fidelidad y robustez líderes en la industria para la amplificación por PCR. Esta novedosa enzima puede extender una kilobase de secuencia en 15 segundos y con una precisión 50 veces mayor que la de la ADN polimerasa Taq.

Se suministra en: 20 mM Tris·HCl, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, estabilizador y 50% glicerol; pH 7,4 a 25 °C.

Se suministra con: 5x VeraSeq™ Buffer II (B7102L) y 5x VeraSeq™ GC Buffer (B7130L).

También puede consultarnos sobre formulaciones con bajo contenido de glicerol o de arranque en caliente.

Actuación

Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Endonucleasa bicatenaria: 120 U
Contaminación por ADN de E. coli: 150 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C

Propiedades de la polimerasa Tasa de extensión: 15 segundos por kb a 72 ˚C Corrección (3' → 5' exo): Sí, fuerte Traducción de mella (5' → 3' exo): No Fidelidad: >50x mayor que la Taq ADN polimerasa Desplazamiento de la hebra: No Termoestabilidad: Altamente termoestable Capaz de extender un cebador de ARN: No Se extiende desde una mella: No Genera productos de extremo romo: Sí Lectura de uracilo: No

Principio

Fuente de proteína enzimática recombinante La proteína es producida por una cepa de E. coli recombinante que lleva el gen VeraSeq 2.0 diseñado.

Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 10 nmoles de dNTP en una forma insoluble en ácido a 74 °C en 30 minutos.

Fuente de proteína enzimática recombinante La proteína es producida por una cepa de E. coli recombinante que lleva el gen VeraSeq™ 2.0 diseñado.

Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 10 nmoles de dNTP en una forma insoluble en ácido a 74 °C en 30 minutos.

Procedimiento

Componente: Volumen (µL)
H2O estéril: variable
Tampón VeraSeq™ II 5x o tampón VeraSeq GC 5x: 10
Mezcla de dNTP 10 mM: 1
Primer paso: Variable
Primer 2: Variable
Plantilla de ADN: Variable
ADN polimerasa VeraSeq™ 2.0: 0,5

Paso: Temperatura
Desnaturalización inicial: 98°C
Extensión de recocido por desnaturalización: 98 °C Varía 72 °C
Extensión final: 72°C 4°C
Es posible que sea necesario optimizar las condiciones del ciclo, dependiendo del amplicón de interés.

Complejidad: Ejemplo de fuente
Bajo: Plásmido, virus, BAC
Alto: ADN genómico

- El tampón VeraSeq™ II 5X debe usarse como tampón predeterminado para la amplificación de alta fidelidad. Para plantillas complejas y con alto contenido de GC, utilice el tampón VeraSeq™ GC 5X.
La ADN polimerasa de alta fidelidad VeraSeq™ 2.0 se bloquea en los residuos de uracilo de la cadena molde, impidiendo así una mayor extensión. Por lo tanto, no se debe utilizar dUTP en la reacción. Si las plantillas de ADN contienen uracilo o es necesario incorporar dUTP, utilice VeraSeq™ ULtra (P7520L).
- Se recomienda una concentración final de 0,2 µM para cada cebador, pero puede variarse en el rango de 0,2 – 1 µM.
- Cantidades de plantilla recomendadas: Complejidad Ejemplo de fuente Guía Bajo Plásmido, virus, BAC 1 pg – 10 ng Alto ADN genómico 50–250 ng
Una unidad suele ser suficiente para amplificar la mayoría de los objetivos. Para objetivos largos (>1 kb), plantillas complejas o para aumentar el rendimiento, puede ser necesario añadir hasta 2 unidades de enzima.
Tanto el tampón VeraSeq™ II 5X como el tampón GC están formulados para proporcionar una concentración final de MgCl₂ 1X de 1,5 mM. Si se requiere Mg₂+ adicional, ajuste la concentración final de Mg₂+ en incrementos de 0,2 mM.
Para plantillas ricas en cromatografía de gases, se puede usar DMSO para reducir la estructura secundaria de plantillas complejas. El DMSO se utiliza generalmente a una concentración final del 3 % (v/v). Si se requiere una optimización adicional, ajuste la concentración en incrementos del 1 % al 2 % (del 2 % al 9 % en la reacción final). La temperatura de hibridación del cebador debe reducirse para tener en cuenta la presencia del disolvente.
- La ADN polimerasa de alta fidelidad VeraSeq™ 2.0 también es compatible con otros aditivos que mejoran la PCR, como BSA y betaína.

Protocolo: Se deben tomar precauciones generales al preparar una PCR, incluyendo la preparación de la reacción en hielo, la adición final de la polimerasa, el pipeteo suave, la mezcla completa y una centrifugación rápida. El siguiente procedimiento puede utilizarse como guía. Es posible que sea necesario optimizar las reacciones individualmente.

Configuración de la reacción (para 50 µl)

El volumen total de reacción se puede ajustar según sea necesario.

Condiciones típicas de ciclismo

Notas de uso:

Análisis de control de calidad

La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción 1x y se añadieron a reacciones de 50 µl que contenían ADN de timo de ternera activado; TAPS (ácido tris-[hidroximetil]-metil-amino-propanosulfónico, sal sódica) 25 mM, pH 9,3 a 25 °C; KCl 50 mM; MgCl₂ 2 mM; β-mercaptoetanol 1 mM; dATP, dGTP y dTTP 200 µM de cada uno; y [3H]-dCTP 100 µM (0,075 Ci/mmol). Los recipientes de reacción se mezclaron e incubaron a 74 °C durante 10 minutos.

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µl que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µl de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación del ADNr 16S de E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µl de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Amplificación de alta fidelidad
- Amplificación larga
- Clonación
- Biología sintética

Este producto está disponible para las siguientes aplicaciones de biología molecular: