Qiagen, P7520L, ADN polimerasa VeraSeq ULtra (500 U)

500 U de ADN polimerasa VeraSeq ULtra, tampón VeraSeq II 5X y tampón VeraSeq GC 5X.

Características

- Leer y utilizar residuos de uracilo con máxima velocidad y precisión
- Polimerasa ultratermoestable
- 25 veces mayor fidelidad que la ADN polimerasa Taq
- Funciones en concentraciones de Mg 2+ 1,5 a 3,0 mM
- Fuerte función de corrección (exonucleasa 3'-5')
- OEM de QIAGEN ofrece fabricación a granel de VeraSeq ULtra DNA Polymerase en formulaciones personalizadas, incluidas formulaciones con bajo contenido de glicerol o de inicio en caliente.

Detalles del producto

La ADN polimerasa VeraSeq™ ULtra es una polimerasa ultratermoestable y alfabetizada en uracilo, diseñada para maximizar la velocidad, precisión y duración de la síntesis de ADN durante la preparación de plantillas de secuenciación. El resultado es una enzima novedosa que puede leer a través del uracilo, extender una kilobase de secuencia en 15 segundos y tiene una precisión 25 veces mayor que la ADN polimerasa Taq.

Se suministra en: 20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, estabilizador y 50% glicerol; pH 7,4 a 25°C.

Se suministra con: 5X VeraSeq™ Buffer II (B7102L) y 5X VeraSeq™ GC Buffer (B7130L).

Puede consultarnos sobre formulaciones con bajo contenido de glicerol o de arranque en caliente.

Actuación

Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Endonucleasa bicatenaria: 120 U
Contaminación por ADN de E. coli: 150 U

Propiedades de la polimerasa Tasa de extensión: 15 segundos por kilobase a 72 ˚C Corrección (3'-5' exo): Sí, fuerte Traducción de mella (5'-3' exo): No Fidelidad: > 25 veces mayor que la Taq ADN polimerasa Desplazamiento de la hebra: No Termoestabilidad: Altamente termoestable Capaz de extender un cebador de ARN: No Se extiende desde una mella: No Genera productos finales romos: Sí Lectura de uracilo: Sí Temperatura de almacenamiento: –25 °C a –15 °C

Principio

Fuente de proteína enzimática recombinante La proteína es producida por una cepa de E. coli recombinante que lleva el gen VeraSeq™ ULtra diseñado.

Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 10 nmoles de dNTP en una forma insoluble en ácido a 74 °C en 30 minutos.

Procedimiento

Componente: Volumen (µl)
H2O estéril: variable
Tampón VeraSeq™ II 5X o tampón GC VeraSeq™ 5X: ULtra
Mezcla de dNTP 10 mM: 1
Primer paso: Variable
Primer 2: Variable
Plantilla de ADN: Variable
VeraSeq™ ULtra ADN polimerasa: 0,5

Paso: Temperatura
Desnaturalización inicial: 98°C
Extensión de recocido por desnaturalización: 98 °C Varía 72 °C
Extensión final: 72°C 4°C
Es posible que sea necesario optimizar las condiciones del ciclo, dependiendo del amplicón de interés.

Complejidad: Ejemplo de fuente
Bajo: Plásmido, virus, BAC
Alto: ADN genómico

Protocolo: Se deben tomar precauciones generales al preparar la PCR, incluyendo la preparación de la reacción en hielo, la adición final de la polimerasa, el pipeteo suave, la mezcla completa y una centrifugación rápida. El siguiente procedimiento puede utilizarse como guía. Es posible que sea necesario optimizar las reacciones individualmente.

El volumen total de reacción se puede ajustar según sea necesario.

Notas de uso:

1. El tampón VeraSeq™ II 5X debe usarse como tampón predeterminado para la amplificación de alta fidelidad. Para moldes complejos y ricos en GC, use el tampón VeraSeq™ GC 5X. 2. La ADN polimerasa VeraSeq™ 2.0 ULtra puede usarse en la amplificación por PCR para generar productos que contengan desoxiuridina mediante la inclusión de dUTP en la reacción. Si el molde de ADN contiene uracilo o es necesario incorporar dUTP, use VeraSeq Ultra (P7520L). 3. Se recomienda una concentración final de 0,2 µM para cada cebador, pero puede variarse entre 0,2 y 1 µM. 4. Cantidades recomendadas de molde:

5. Una unidad suele ser suficiente para amplificar la mayoría de los objetivos. Para objetivos largos (>1 kb), plantillas complejas o para aumentar el rendimiento, puede ser necesario añadir hasta 2 unidades de enzima.

6. Tanto el tampón VeraSeq™ II 5X como el tampón GC están formulados para proporcionar una concentración final de MgCl₂ 1X de 1,5 mM. Si se requiere Mg₂+ adicional, ajuste la concentración final de Mg₂+ en incrementos de 0,2 mM.

7. Para plantillas ricas en cromatografía de gases, se puede usar DMSO para reducir la estructura secundaria de plantillas complejas. El DMSO se usa generalmente a una concentración final del 3 % (v/v). Si se requiere una optimización adicional, ajuste la concentración en incrementos del 1 % al 2 % (del 2 % al 9 % en la reacción final). La temperatura de hibridación del cebador debe reducirse para tener en cuenta la presencia del disolvente.

8. La ADN polimerasa VeraSeq™ ULtra también es compatible con otros aditivos que mejoran la PCR, como BSA y betaína.

Análisis de control de calidad

La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción 1X y se añadieron a reacciones de 50 µl que contenían ADN de timo de ternera activado; TAPS (ácido tris-[hidroximetil]-metil-amino-propanosulfónico, sal sódica) 25 mM, pH 9,3 a 25 °C; KCl 50 mM; MgCl₂ 2 mM; β-mercaptoetanol 1 mM; dATP, dGTP y dTTP 200 µM de cada uno; y [3H]-dCTP 100 µM (0,075 Ci/mmol). Los recipientes de reacción se mezclaron e incubaron a 74 °C durante 10 minutos.

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µl que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µl de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación del ADNr 16S de E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µl de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Amplificación de ADN de alta fidelidad
- Clonación
- Biología sintética

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: