Qiagen, P7590L, ADN polimerasa Phoenix Hot Start Taq (500 U)

500 U de ADN polimerasa Phoenix Hot Start Taq (0,10 ml a 5000 U/ml), tampón de reacción Phoenix Hot Start Taq 5x (4 x 1,5 ml) y tampón de reacción GC Phoenix Hot Start Taq 5x (2 x 1,5 ml)

Características

- ADN polimerasa termoestable 5ʹ→3ʹ con inicio en caliente mediado por anticuerpos
- Mayor especificidad, sensibilidad y rendimiento en las reacciones de PCR.
- Carece de una función de corrección de pruebas 3ʹ→5ʹ pero conserva la actividad de exonucleasa 5ʹ→3ʹ
- Estabilidad de 72 horas a temperatura ambiente para una configuración sencilla y flujos de trabajo automatizados
- Tolerancia a amplios rangos de Mg2+ y temperaturas de recocido

Detalles del producto

La ADN polimerasa Taq Hot Start de Phoenix™ proporciona un inicio en caliente basado en anticuerpos para un rendimiento de PCR sólido con una excepcional estabilidad a temperatura ambiente durante el ciclo previo a la PCR.

Se suministra en: 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, estabilizador y 50% glicerol; pH 7,5 a 25 °C.

Se suministra con: tampón de reacción Phoenix Hot Start Taq 5X (B7590) y tampón de reacción Phoenix Hot Start Taq GC 5X (B7591)

OEM de QIAGEN ofrece fabricación a granel de ADN polimerasa Phoenix Hot Start Taq en formulaciones personalizadas, incluidas formulaciones con bajo contenido de glicerol y sin glicerol.

Actuación

Prueba: Unidades probadas
Pureza: N/A
Actividad específica: N/A
Exonucleasa monocatenaria: 50 U
Exonucleasa bicatenaria: 50 U
Endonucleasa bicatenaria: 50 U
Inhibición de Taq: N/D
Ensayo funcional: N/A

- Mayor especificidad de amplificación en comparación con la ADN polimerasa Taq normal
- Mayor rendimiento de amplificación y tasa de éxito general.
- Reactivación rápida y tiempo de ciclo de PCR más corto con el método de anticuerpos
- Amplificación de alta sensibilidad con 300 pg de ADN genómico humano
- Capacidad de multiplexación con optimización mínima
- Altas tasas de éxito con objetivos ricos en GC

La ADN polimerasa Taq de inicio rápido Phoenix es una ADN polimerasa Taq recombinante termoestable complejada con un anticuerpo neutralizante termoestable que bloquea la actividad de la polimerasa 5ʹ→3ʹ antes del paso inicial de desnaturalización del ADN de la PCR (1, 2). Esta capacidad de inicio rápido mediada por anticuerpos mejora la especificidad, la sensibilidad y el rendimiento generales de la PCR al reducir la amplificación inespecífica y la formación de dímeros de cebador antes del ciclado de la PCR y permite la conveniencia de configurar la reacción a temperatura ambiente. Cuando la temperatura de la mezcla de PCR alcanza ≥94 °C durante el paso inicial de desnaturalización del ADN del ciclado de la PCR, la actividad de la ADN polimerasa Taq se restaura por completo. La ADN polimerasa Taq de inicio rápido Phoenix, al igual que la ADN polimerasa Taq estándar, también tiene actividad de exonucleasa 5ʹ→3ʹ, pero carece de cualquier actividad de exonucleasa 3ʹ→5ʹ detectable.

Propiedades de la polimerasa

Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C

Principio

Fuente de proteína enzimática recombinante: una cepa de E. coli recombinante que lleva el gen de la ADN polimerasa Taq del organismo termófilo Thermus aquaticus YT-1 complejado con un anticuerpo monoclonal derivado de un cultivo de células murinas.

Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 10 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 75 °C.

Peso molecular: 94 kDa

Temperatura óptima de extensión: 66–72 °C

Velocidad de extensión: 60 segundos por kilobase a 72˚C

Corrección de pruebas (exo de 3'-5'): No

Traducción de apodo (exo de 5'-3'): Sí

Desplazamiento de la hebra: No

Se extiende desde un apodo: Sí

Procedimiento

Componente: Volumen (µl)
H2O estéril: variable
5x Phoenix Hot Start Taq Reaction Buffer o 5x Phoenix Hot Start Taq GC Reaction Buffer: 10
Mezcla de dNTP 10 mM: 1
Primer paso: Variable
Primer 2: Variable
Plantilla de ADN: Variable
ADN polimerasa Phoenix Hot Start Taq: 0,2

Paso: Temperatura
Desnaturalización inicial*: 94°C
Extensión de recocido por desnaturalización: 94 °C Varía 72 °C
Extensión final: 72°C 4°C

Complejidad: Fuente (ejemplo)
Bajo: Plásmido, virus, BAC
Alto: ADN genómico

Se deben tomar precauciones generales al configurar la PCR, incluyendo medidas para evitar la contaminación cruzada y asegurar un pipeteo cuidadoso, una mezcla completa y una centrifugación breve después de añadir todos los componentes a la reacción. El siguiente procedimiento puede utilizarse como guía. Es posible que sea necesario optimizar las reacciones individualmente según el resultado deseado.

Las tablas a continuación proporcionan información para reacciones de 50 µl y condiciones típicas de ciclado. El volumen total de reacción puede ajustarse según sea necesario. Es posible que sea necesario optimizar las condiciones de ciclado según el amplicón de interés.

* Necesario para la desnaturalización de la plantilla y la activación de la polimerasa Phoenix Hot Start Taq.

Notas de uso 1. Se debe utilizar el tampón Phoenix Hot Start Taq 5x como tampón predeterminado. Para plantillas complejas y con alto contenido en GC, utilice el tampón Phoenix Hot Start Taq GC 5x. 2. Se recomienda una concentración final de 0,2 µM para cada cebador, pero puede variarse entre 0,2 y 1 µM. 3. La siguiente tabla muestra las cantidades recomendadas de plantilla.

4. Una unidad de enzima suele ser suficiente para amplificar la mayoría de las dianas, pero puede requerirse una mayor cantidad (hasta 2,5 unidades) en PCR multiplex o para aumentar el rendimiento de dianas difíciles o largas. 5. Tanto el tampón Phoenix Hot Start Taq 5x como el tampón GC están formulados para proporcionar 2 mM de Mg₂₄ en la reacción final (es decir, al diluirse a 1x). Si se requiere una optimización adicional de Mg₂₄, ajuste la concentración final de Mg₂₄ en incrementos de 0,2 mM.

Análisis de control de calidad

La funcionalidad de la ADN polimerasa Phoenix Hot Start Taq se evalúa mediante su capacidad para amplificar dianas de ADN mediante PCR en los tampones de reacción B7590 y B7591 tras una incubación de 24 horas a temperatura ambiente. Tras la activación térmica y la amplificación por PCR, las muestras dieron lugar a amplicones de banda única visibles, determinados mediante electroforesis en gel de agarosa.

La inhibición de Taq se mide mediante la actividad residual de la ADN polimerasa Phoenix Hot Start Taq en ausencia de un paso de activación térmica a ≥ 94 °C. La ADN polimerasa Phoenix Hot Start Taq y la ADN polimerasa Taq (ADN polimerasa Taq sin anticuerpo Taq) se incubaron en presencia de ADN de timo de ternera, 50 µM de 3H-dTTP, 100 µM de dNTP y tampón de reacción 1X B7590 o B7591. Tras una incubación de 24 horas a temperatura ambiente, se analizaron las muestras para determinar el recuento total de 3H-dTTP incorporado mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µl que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µl de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µl que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µl de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µl que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µl de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

Aplicaciones

- Amplificación por PCR de rutina hasta 5 kb
- PCR de alto rendimiento
- Extensión de cebador
- PCR multiplex y RT-PCR
- qPCR y RT-qPCR en tiempo real basadas en sonda o colorante

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias 1. Chou, Q., et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 1717. 2. Sharkey, D., et al. (1994) Nature Biotechnology 12: 506.