Product Description
10 000 U de transcriptasa inversa EnzScript (0,05 mL a 200 000 U/mL) y tampón 5x M-MLV de transcriptasa inversa RNasa H Minus (1 x 1,5 mL) y 100 mM de DTT (1 x 1,5 mL)
Características
- M-MLV deficiente en ARNasa H con mayor estabilidad térmica
- Adecuado para clonación de ADNc y RT-PCR
- Recomendado para la construcción de bibliotecas para estudios del transcriptoma RNA-Seq
- Compatible con hexámeros aleatorios, oligo(dT) y cebado específico de genes.
Detalles del producto
La transcriptasa inversa EnzScript es una transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) con mutaciones puntuales en el dominio de la ARNasa H que eliminan la actividad detectable de esta última. EnzScript puede utilizarse para generar ADNc de primera cadena a partir de ARNm poli(A) o ARN total para su uso en aplicaciones posteriores como RT-PCR, clonación de ADNc o construcción de bibliotecas para RNA-Seq. Las mutaciones puntuales en el dominio de la ARNasa H aumentan la termoestabilidad de la enzima y permiten una mayor producción de ADNc de transcripciones completas que la transcriptasa inversa M-MLV de tipo silvestre.
Una unidad de transcriptasa inversa EnzScript se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 1 nmol de dTTP en material insoluble en ácido en 10 minutos a 37 °C utilizando poli r(A)/oligo(dT) como sustrato.
La transcriptasa inversa EnzScript se suministra en 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, <0,01 % estabilizador NP-40 y 50 % glicerol; pH 7,5 a 25 °C.
La transcriptasa inversa EnzScript se suministra con tampón de reacción 5X M-MLV Reverse Transcriptase RNase H (n.º de cat. B7601) y 100 mM DTT (n.º de cat. B9060).
Actuación
Prueba: Especificación
Pureza: >95%
Actividad específica: 180.000 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: 2000 U <5 % liberadas
Exonucleasa bicatenaria: 2000 U <1% liberadas
Endonucleasa bicatenaria: 2000 U = Sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 2000 U <10 copias
Contaminación por ARNasa: 2000 U; No se detectó ARNasa no específica
Ensayo de RT-PCR funcional: síntesis de transcripción de ADNc de 9,4 kb
- Temperatura óptima de extensión: 42°C
- Longitud de la transcripción: hasta 9,4 kb
Propiedades de la polimerasa
Principio
La transcriptasa inversa (RT), también conocida como ADN polimerasa dependiente de ARN, es una enzima ADN polimerasa que transcribe el ARN monocatenario en ADN. Virus como el VIH y la hepatitis B utilizan la transcriptasa inversa para replicar sus genomas.
Las transcriptasas inversas se utilizan en biología molecular para detectar y manipular moléculas de ARN mediante amplificación. Las transcriptasas inversas polimerizan una cadena de ADN (ADNc) complementaria a una plantilla de ARN original. El ADNc puede amplificarse posteriormente mediante PCR y qPCR para el análisis posterior de las transcripciones y la expresión génica.
La RT retroviral nativa posee tres actividades bioquímicas secuenciales: actividad de la ADN polimerasa dependiente de ARN, actividad de la ribonucleasa H (RNasa H) y actividad de la ADN polimerasa dependiente de ADN. En conjunto, estas actividades permiten a la enzima convertir el ARN monocatenario en ADNc bicatenario.
La actividad de la ARNasa H degrada la cadena de ARN de un híbrido ADN/ARN y libera la nueva cadena de ADN para su uso como molde en la síntesis de la segunda cadena de ADN. La actividad de la ARNasa H se considera desventajosa para la síntesis de ADNc largos debido a su potencial para degradar el molde de ARN antes de completar la transcripción inversa completa.
La transcriptasa inversa EnzScript no presenta actividad detectable de ARNasa H y presenta mayor termoestabilidad. Esta enzima es adecuada para generar ADNc de primera cadena a partir de ARNm poli(A) o ARN total para su uso en aplicaciones posteriores como RT-PCR, clonación de ADNc o construcción de bibliotecas para secuenciación de ARN.
Procedimiento
Las instrucciones para utilizar la transcriptasa inversa EnzScript se proporcionan en el protocolo del kit correspondiente en los recursos a continuación.
Control de calidad
La actividad unitaria de la transcriptasa inversa EnzScript se midió mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en tampón H de ARNasa RT M-MuLV 1X y se añadieron a reacciones de 50 μL que contenían 20 μg/mL de poli r(A) ARN, oligo (dT) ADN, tampón RT 1X, 3H-dTTP y 250 μM de dTTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se sumergieron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).
La concentración de proteína de la transcriptasa inversa EnzScript (OD 280) se determinó mediante la absorbancia de OD 280.
La pureza física de la transcriptasa inversa EnzScript se evaluó mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección con tinción de plata. La pureza se evaluó comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.
La actividad de exonucleasa monocatenaria en la transcriptasa inversa EnzScript se determinó en una reacción de 50 μL que contenía un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la exonucleasa bicatenaria en la transcriptasa inversa EnzScript se determinó en una reacción de 50 μL que contenía un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de endonucleasa bicatenaria en la enzima transcriptasa inversa EnzScript se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 0,5 μg de ADN plasmídico y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La contaminación de la transcriptasa inversa EnzScript por E. coli se evaluó utilizando muestras replicadas de 5 μL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.
La contaminación por ARNasa no específica de la transcriptasa inversa EnzScript se evaluó utilizando un kit de detección de nucleasas siguiendo las pautas del fabricante.
La función de la transcriptasa inversa de EnzScript se determinó mediante la capacidad de la enzima para generar un transcrito de ADNc de 9,4 kB. Tras la RT-PCR de dos pasos, el amplicón de 9,4 kB se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa.
Aplicaciones
- Amplificación por RT-PCR
- clonación de ADNc
- Construcción de bibliotecas para RNA-Seq
Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:
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