Product Description
5000 U de ADN polimerasa TaqIT (50 000 U/mL) y tampón de reacción TaqIT 10x.
Características
- Derivado deficiente en exonucleasa de la ADN polimerasa Taq
- Más termoestable y de mayor fidelidad que la ADN polimerasa Taq de longitud completa
Detalles del producto
La ADN polimerasa TaqIT es un derivado de la ADN polimerasa Taq deficiente en exonucleasa.
La enzima se suministra en 20 mM Tris-HCl, 222 mM (NH4)2SO4, 10 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM EDTA, 0,1% Brij 58 y 50% glicerol; pH 8,6 a 25 °C.
El tampón de reacción TaqIT 10x contiene 500 mM Tris-HCl, 160 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 35 mM MgCl 2 y 0,25 % Brij 58; pH 9,2 a 25 °C.
Actuación
Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 500
Exonucleasa bicatenaria: 500
Endonucleasa bicatenaria: 500
Contaminación por ADN de E. coli: 500
- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 62.407 Daltons
Principio
La ADN polimerasa TaqIT es un derivado deficiente en exonucleasa de la ADN polimerasa Taq. La ADN polimerasa TaqIT carece de los primeros 280 aminoácidos de la Taq polimerasa nativa, que contienen el dominio exonucleasa 5ʹ→3ʹ. Esta deleción hace que la enzima TaqIT sea ligeramente más termoestable y tenga una fidelidad ligeramente mayor que la enzima Taq completa. Al igual que la Taq polimerasa, la ADN polimerasa TaqIT carece de actividad exonucleasa 3ʹ→5ʹ inherente.
Una cepa de E. coli recombinante que porta el gen TaqIT del organismo termófilo Thermus aquaticus YT-1.
Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 10 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 75 °C.
Procedimiento
Componente: Volumen (µL)
H 2 O libre de nucleasas: x
Tampón de reacción TaqIT 10x (B7620): 5
Mezcla de dNTP 10 mM: 1
Primer 1: x
Primer 2: x
Plantilla de ADN: x
TaqIT (P7620L): 0,1–0,5
Paso: Temperatura
Desnaturalización inicial: 94°C
Desnaturalización: 94°C
Recocido: 50–65 °C
Extensión: 72°C
Extensión final: 72°C
4°C
Instrucciones de uso
Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 50 µL
Nota: Los volúmenes se pueden ajustar según sea necesario.
Condiciones para el ciclismo
Nota: Es posible que sea necesario optimizar las condiciones del ciclo según el amplicón de interés.
Control de calidad
La actividad específica se midió mediante un método de dilución seriada doble. La enzima se diluyó en una solución de almacenamiento de ADN polimerasa TaqIT con glicerol reducido (5 %) y se añadió a reacciones de 50 µL que contenían ADN de timo de ternera, 25 mM de TAPS (pH 9,3), 50 mM de KCl, 1 mM de DTT, 3H-dTTP y 100 µM de dNTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 75 °C, se colocaron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).
La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.
La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.
La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.
Aplicaciones
- Productos de PCR más largos que la polimerasa Taq estándar
- Genotipado
- Barnes WM. (1992) La fidelidad de la PCR catalizadora de la Taq polimerasa se mejora mediante una deleción del extremo N-terminal. Gene 112:29.
- Karantzeni, I., Ruiz, C., Liu, CC., Licata, VJ (2003) Desnaturalización térmica comparativa de las ADN polimerasas de Thermus aquaticus y Escherichia coli tipo 1. Biochem J. 374:785.
Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:
Referencias
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