Qiagen, P7670L, 2x HiFi PCR Master Mix (24 reacciones)

Para 24 reacciones: 2x HiFi PCR Master Mix (1 x 0,6 mL) y HiFi Enhancer (1 x 0,25 mL)

Características

- Alta sensibilidad y eficiencia de amplificación mejorada en aplicaciones NGS
- Presenta un sesgo mínimo en la amplificación de la biblioteca de ADN.
- Excelente cobertura del genoma incluso en regiones con GC extremadamente alto

Detalles del producto

2x HiFi PCR Master Mix es una mezcla maestra de PCR de alta eficiencia, alta fidelidad y bajo sesgo para la amplificación de bibliotecas NGS.

2x HiFi PCR Master Mix se suministra con HiFi Enhancer (n.º de cat. M0313L).

Actuación

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C

Propiedades de la mezcla

Principio

La mezcla maestra para PCR 2x HiFi (P7670L) es una solución lista para usar que contiene todos los componentes necesarios para la amplificación de bibliotecas NGS, incluyendo una ADN polimerasa HiFi de arranque en caliente en un tampón optimizado para garantizar una alta eficiencia, alta fidelidad y amplificaciones con bajo sesgo. Las bibliotecas NGS generadas con una cantidad limitada de material de partida suelen requerir amplificación por PCR para generar suficientes plantillas para su cuantificación y secuenciación. Las bibliotecas amplificadas con la mezcla maestra para PCR 2x HiFi presentan un sesgo mínimo, una baja tasa de error y una excelente cobertura genómica, incluso en regiones con GC extremadamente bajo o alto. Estas características ayudan a minimizar el sesgo de secuenciación, reducir la tasa de duplicación y mejorar la calidad de los datos y la uniformidad de la cobertura.

Procedimiento

Paso: Temperatura
Desnaturalización inicial: 98°C
Desnaturalización: 98°C
Recocido: 60°C*
Extensión: 72°C
Extensión final: 72°C
Mantenimiento: 4°C

Componentes: Volumen para una reacción (µl)
Plantilla de ADN: X
Mezcla maestra PCR HiFi 2X: 25
Mezcla de imprimación: Y
Agua libre de nucleasas: 25–X–Y
Total: 50

Paso: Temperatura
Desnaturalización inicial: 98°C
Desnaturalización: 98°C
Recocido: 60°C
Extensión: 72°C
Extensión final: 72°C
Mantener: 4°C

Componentes: Volumen para 1 reacción (µL)
Perlas con plantilla de ADN capturado: X
2x Mezcla maestra PCR HiFi: 25
Mezcla de imprimación*: Sí
Potenciador de alta fidelidad†: 2
Agua libre de nucleasas: 23-XY
Volumen total: 50

N.º de cat.: Descripción
Y9410L: Mezcla de fragmentación 5X WGS
Y9420L: Mezcla de enzimas de cola ER/A 5X
L6030-WL: Ligasa de ADN T4 (NGS)

Programe un termociclador con los parámetros que se indican en la tabla a continuación. Ajuste la tapa calefactada del instrumento a 105 °C. Cuando el bloque del termociclador alcance los 98 °C, pause el programa. Paso Temperatura Tiempo de incubación Número de ciclo Desnaturalización inicial 98 °C 45 s 1 Desnaturalización 98 °C 15 s Según sea necesario* Anexión 60 °C 30 s Extensión 72 °C 30 s Extensión final 72 °C 1 min 1 Mantenimiento 4 °C ∞ N/D * El número de ciclos de PCR debe optimizarse según las directrices del proveedor de la sonda de captura.
Prepare la mezcla de reacción de amplificación postcaptura en un tubo aparte, según la tabla a continuación. Componentes: Volumen para 1 reacción (µL): Microesferas con ADN capturado molde X 2x HiFi PCR Master Mix 25; Mezcla de cebadores* Y HiFi Enhancer† 2; Agua libre de nucleasas 23-XY; Volumen total 50. * Una concentración final de 0,5 μM de cada cebador para la amplificación en microesferas. Siga las instrucciones del fabricante/proveedor. † Se deben añadir de 2 a 2,5 μL de HiFi Enhancer a cada reacción para garantizar una alta eficiencia de amplificación en microesferas. Si utiliza un mayor volumen de microesferas, ajuste la cantidad de HiFi Enhancer según corresponda.
Pipetee hacia arriba y hacia abajo para asegurar la mezcla de los componentes. Centrifugue suavemente, pero asegúrese de que las perlas permanezcan en la solución.
- Transfiera el tubo de reacción al termociclador precalentado (98 °C). Reanude el programa de ciclado.
- Cuando el programa del termociclador se haya completado y el bloque de muestra haya regresado a 4 °C, retire la muestra del bloque y proceda inmediatamente a la limpieza posterior a la amplificación utilizando perlas QIAseq u otro método de purificación deseado.
- Validar y cuantificar la librería mediante electroforesis en gel, qPCR y/o Bioanalizador.

1. Programe un termociclador con los parámetros que se indican en la tabla a continuación. Ajuste la tapa calefactada del instrumento a 105 °C. Cuando el bloque del termociclador alcance los 98 °C, pause el programa.

*Puede ser necesario optimizar la temperatura de recocido.

† El número de ciclos de amplificación debe ajustarse en función de la concentración de la plantilla de ADN, las concentraciones de cebadores y un rendimiento de la biblioteca de ADN suficiente para aplicaciones posteriores.

‡ Se recomienda entre 30 y 60 segundos/kb al decidir el tiempo de extensión.

2. Prepare la PCR en un tubo nuevo en hielo combinando la plantilla de ADN, la mezcla maestra HiFi PCR 2X y los cebadores suministrados por el cliente, como se describe en la tabla a continuación. Mezcle bien pipeteando de 8 a 10 veces. Los volúmenes se pueden ajustar según sea necesario.

3. Centrifugue el tubo de muestra y transfiéralo inmediatamente al termociclador precalentado (98 °C). Reanude el programa de ciclado.

4. Cuando se complete el programa del termociclador y el bloque de muestra haya regresado a 4 °C, retire la muestra del bloque y proceda inmediatamente a la limpieza posterior a la amplificación utilizando perlas AMPureXP u otro método de purificación deseado.

5. Validar y cuantificar la biblioteca mediante electroforesis en gel, qPCR y/o Bioanalizador.

Enriquecimiento por PCR posterior a la captura

La mezcla maestra para PCR 2x HiFi es compatible con flujos de trabajo de enriquecimiento de dianas, como aquellos que utilizan sondas y paneles de captura de hibridación basados ​​en microesferas. Las siguientes instrucciones están validadas para la amplificación por PCR de dianas enriquecidas con sondas xGen Lockdown y reactivos de IDT. En este flujo de trabajo, las dianas que se van a amplificar se inmovilizan en microesferas de estreptavidina Dynabeads M-270. Si se utilizan otros tipos de microesferas de captura, es posible que sea necesario optimizar la reacción.

Análisis de control de calidad

La funcionalidad de la mezcla maestra HiFi PCR se prueba mediante la amplificación de una biblioteca de ADN preparada a partir de ADN genómico bacteriano mixto con un contenido de GC del 10 al 80 %. Las diferencias en el rendimiento y el perfil de la biblioteca entre diferentes lotes no deben superar el 15 %. La secuenciación de la biblioteca amplificada debe producir lecturas mapeadas superiores al 90 % y una cobertura normalizada de entre 0,7 y 1,3 en todo el espectro de GC.

Aplicaciones

- Amplificación de la biblioteca NGS

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: