Qiagen, P7720L, transcriptasa inversa StableScript (250 U)

250 U de transcriptasa inversa StableScript (0,05 mL a 5000 U/mL) y tampón de reacción StableScript 4x (1 x 1,5 mL)

Características

- Transcriptasa inversa versátil adecuada para RT-PCR y RT-qPCR de un solo paso
- Recomendado para RT-PCR de largo alcance
- Detección de ARN de alta sensibilidad
- Mejora de la termoestabilidad, procesividad y resistencia a los inhibidores.

Detalles del producto

StableScript es una transcriptasa inversa versátil diseñada para su uso en RT-qPCR de un solo paso y RT-PCR de largo alcance. La transcriptasa inversa StableScript no presenta actividad detectable de ARNasa H y presenta una mayor termoestabilidad, con un buen rendimiento en un rango de temperatura de 45 a 65 °C. Esto ayuda a superar los desafíos de detección de dianas de ARN complejas y permite altos rendimientos de ADNc. La transcriptasa inversa StableScript muestra un rendimiento fiable en presencia de inhibidores comunes.

Una unidad de transcriptasa inversa StableScript se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 1 nmol de dTTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 55 °C utilizando poli r(A)/oligo(dT) como sustrato.

La enzima se suministra en 20 mM KPO4, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, estabilizador, 50% glicerol; pH 7,0 a 25°C.

La enzima se suministra con un tampón de reacción StableScript 4X.

Actuación

Prueba: Especificación
Pureza: >99%
Exonucleasa monocatenaria: 5000 U <5 % liberadas
Exonucleasa bicatenaria: 5000 U <1% liberadas
Endonucleasa bicatenaria: 5000 U = Sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 5000 U <10 copias
Contaminación por ARNasa: 5000 U; No se detecta ARNasa no específica
Ensayo RT-PCR funcional: amplificación del lote de prueba a 1 Ct del lote de referencia en un ensayo RT-qPCR de un solo paso

- Temperatura óptima de extensión: 55°C
- Longitud de la transcripción: hasta 12,3 kb

Propiedades de la polimerasa

Principio

La transcriptasa inversa (RT), también conocida como ADN polimerasa dependiente de ARN, es una enzima ADN polimerasa que transcribe ARN monocatenario en ADN. Virus como el VIH y la hepatitis B utilizan la transcriptasa inversa para replicar sus genomas, y los retrotransposones para proliferar dentro del genoma del huésped.

Las transcriptasas inversas se utilizan en biología molecular para detectar y manipular moléculas de ARN mediante amplificación. Las transcriptasas inversas polimerizan una cadena de ADN (ADNc) complementaria a una plantilla de ARN original. El ADNc puede amplificarse posteriormente mediante PCR y qPCR para el análisis posterior de las transcripciones y la expresión génica.

La actividad de la ARNasa H degrada la cadena de ARN de un híbrido ADN/ARN y libera la nueva cadena de ADN para su uso como molde en la síntesis de la segunda cadena de ADN. La actividad de la ARNasa H se considera desventajosa para la síntesis de ADNc largos debido a su potencial para degradar el molde de ARN antes de completar la transcripción inversa completa.

La transcriptasa inversa StableScript no presenta actividad detectable de ARNasa H y presenta mayor termoestabilidad. La enzima demuestra alta sensibilidad para la detección de ARN, mayor procesividad y mayor resistencia a los inhibidores.

Procedimiento

Las instrucciones para utilizar la transcriptasa inversa StableScript se proporcionan en el protocolo del kit correspondiente en los recursos a continuación.

Control de calidad

La actividad unitaria de la transcriptasa inversa StableScript se midió mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en diluyente StableScript 1X y se añadieron a reacciones de 50 μL que contenían 20 μg/mL de poli r(A) ARN, oligo (dT) ADN, tampón de reacción StableScript 1X, 3 H-dTTP y 250 μM de dTTP. Se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).

La concentración de proteína de la transcriptasa inversa StableScript (OD 280) se determinó mediante la absorbancia de OD 280.

La pureza física de la transcriptasa inversa StableScript se evaluó mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evaluó comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.

La actividad de exonucleasa monocatenaria en la transcriptasa inversa StableScript se determinó en una reacción de 50 μL que contenía un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria en la transcriptasa inversa StableScript se determinó en una reacción de 50 μL que contenía un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de endonucleasa bicatenaria en la enzima transcriptasa inversa StableScript se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 0,5 μg de ADN plasmídico y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación de la transcriptasa inversa StableScript por E. coli se evaluó utilizando muestras replicadas de 5 μL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores oligonucleotídicos correspondientes al locus del ARNr 16S.

La contaminación por ARNasa no específica de la transcriptasa inversa StableScript se evaluó utilizando un kit de detección de nucleasas siguiendo las pautas del fabricante.

La funcionalidad del ensayo RT-PCR se evaluó mediante la amplificación de tres transcritos de ARNm en un ensayo RT-qPCR de un solo paso. El umbral de amplificación (Ct) del lote de prueba se comparó con el de un lote de referencia.

Aplicaciones

- RT-qPCR
- síntesis de ADNc
- RT-PCR de largo alcance
- Secuenciación de próxima generación

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: