Qiagen, P7730L, StableScript™ One Step RT-qPCR Mix (250 reacciones)

Para 250 reacciones: 10X StableScript™ Enzyme Mix (0,5 ml) y 4X StableScript™ Reaction Buffer (2 x 1,5 mL)

Características

- Capaz de multiplexar manteniendo la sensibilidad y especificidad
- Formulado con transcriptasa inversa StableScript™ con termoestabilidad, procesividad y resistencia a inhibidores mejoradas.
- Detecta tan sólo 0,1 pg de ARN en un ensayo de 4 plex
- Excelente consistencia de lote a lote

Detalles del producto

La mezcla StableScript™ One-Step RT-qPCR es una formulación de RT-qPCR altamente eficiente y sensible para la detección de ADN y ARN mediante sondas de hidrólisis. Esta mezcla enzimática 10X contiene una nueva transcriptasa inversa ARNasa H-minus con mayor termoestabilidad y resistencia a inhibidores (StableScript™), una ADN polimerasa de inicio rápido (Phoenix™) y potenciadores específicos para aumentar la sensibilidad y la resistencia a inhibidores.

La mezcla RT-qPCR de un solo paso StableScript™ se suministra con 4X StableScript™ Reaction Buffer B7720L, que contiene dNTP y magnesio.

Actuación

- Formulación de qPCR para detección mediante sondas de hidrólisis
- Resistencia robusta a los inhibidores
- Capaz de multiplexar manteniendo la sensibilidad y especificidad
- Detecta tan sólo 0,1 pg de ARN en un ensayo de 4 plex
- Mayor termoestabilidad con síntesis óptima de ADNc de 50ºC a 65ºC
- Estable en la mesa durante la noche.
- Excelente rango dinámico en una variedad de sistemas de ensayo
- Consistencia excepcional entre lotes

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C

La mezcla StableScript™ One-Step RT-qPCR es una combinación de las enzimas StableScript™ Reverse Transcriptase y Phoenix™ Hot Start Taq DNA Polymerase. La StableScript™ Reverse Transcriptase está diseñada para una mayor termoestabilidad. Aumentar la temperatura para la síntesis de ADNc puede ayudar a superar objetivos de ARN complejos, ya que temperaturas más altas ayudan a desentrañar las estructuras del ARN, lo que reduce la probabilidad de obstaculizar la transcripción inversa.

La polimerasa Phoenix™ es una ADN polimerasa Taq recombinante termoestable complejada con un anticuerpo neutralizante termolábil. Esta capacidad de inicio rápido mediada por anticuerpos mejora la especificidad, la sensibilidad y el rendimiento de la reacción de PCR al reducir la amplificación inespecífica y la formación de dímeros de cebadores antes del ciclado. Junto con StableScript™, Phoenix™ crea la mezcla StableScript™ One-Step RT-qPCR, una mezcla de RT-qPCR extremadamente sensible.

Propiedades de la mezcla

Procedimiento

Componentes: Volumen/Rxn
Tampón de reacción StableScript™ 4X: 5 μL
Mezcla de cebadores y sondas: XμL
Mezcla de enzimas StableScript™ 10X: 2 μL
Plantilla de ARN: hasta 2 μL
Agua libre de nucleasas: hasta un volumen de reacción final de 20 μL

Programa de ciclismo estándar* Pasos: Temperatura
Transcripción inversa: 55°C
Activación de Taq/Desnaturalización inicial: 95 °C
Desnaturalización: 95°C
Recocido/Extensión*: 60 °C

El tampón de reacción StableScript™ 4X debe descongelarse completamente y agitarse en vórtex durante 3-5 segundos para mezclar bien. Agitar rápidamente para recoger el contenido.
Prepare la mezcla de cebadores/sondas. Se recomienda una concentración final de 0,4-0,9 μM para cada cebador y de 0,1-0,5 μM para la sonda. Sin embargo, la concentración óptima de cebadores/sondas debe determinarse empíricamente para cada ensayo.
- Determine el número de reacciones a preparar, incluyendo los controles sin plantilla (NTC). Añada un 10 % de volumen adicional para compensar la pérdida de pipeteo.
Siga la tabla a continuación para preparar la mezcla de reacción. Se recomienda preparar una mezcla maestra para minimizar las variaciones y posibles errores. Componentes: Volumen/Rxn: Concentración final: Tampón de reacción StableScript™ 4X, 5 μL; Mezcla de cebador/sonda 1X, XμL; Mezcla de enzimas StableScript™ 10X, 2 μL; ARN molde 1X, hasta 2 μL; 1 pg a 1 µg de ARN total, agua libre de nucleasas, hasta un volumen de reacción final de 20 μL.
- Selle la placa PCR y gire brevemente para recoger el contenido en el fondo.

Configuración de la reacción RT-qPCR de un solo paso de StableScript™

Al preparar una reacción, se deben tomar precauciones generales contra la degradación del molde de ARN. Estas precauciones incluyen preparar la reacción con agua libre de nucleasas, inhibidor de ARNasa, tubos de PCR libres de nucleasas y puntas de pipeta estériles con filtro, añadir la transcriptasa inversa al final, pipetear suavemente, mezclar bien y centrifugar rápidamente. El siguiente procedimiento puede servir de guía. Es posible que sea necesario optimizar las reacciones individualmente.

Condiciones de ciclado térmico:

Las condiciones de programación del ciclismo recomendadas son las siguientes.

*Los parámetros de ciclado se pueden modificar (especialmente la condición de recocido/extensión) para adaptarse a ensayos específicos.

Análisis de control de calidad

La funcionalidad del ensayo RT-PCR se evalúa mediante la amplificación de tres transcritos de ARNm en un ensayo RT-qPCR de un solo paso. El umbral de amplificación (Ct) del lote de prueba se compara con el de un lote de referencia.

Notas:

Los componentes enzimáticos se analizaron antes de la formulación de la mezcla maestra y se encontraron libres de endonucleasas y exonucleasas contaminantes. La pureza de la enzima fue >99%, según lo determinado por SDS-PAGE, y la contaminación insignificante por ADN genómico de E. coli se confirmó mediante qPCR. Se verificó la actividad específica de cada preformulación enzimática.

Aplicaciones

- RT-qPCR de un solo paso.
- Análisis de la expresión génica de dianas de ARN
- Detección y cuantificación de ADN y ARN

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: