Qiagen, RT35-020, inhibidor de ARNasa Hu (2000 U)

Temperatura de almacenamiento: -20°C sin ciclo de descongelación

Características

- Inhibe completamente la actividad de la ARNasa A, ARNasa B y ARNasa C.
- No influye en ninguna actividad de la polimerasa o la transcriptasa inversa.
- Mantiene la estabilidad total a 37 °C durante al menos 4 semanas sin pérdida de actividad.
- Activo en diversas condiciones de reacción y en varios tampones.
- Libre de actividad DNasa y RNasa

Detalles del producto

El inhibidor de ARNasa Hu es una proteína placentaria humana recombinante de 50 kDa, térmicamente resistente, expresada en Escherichia coli que inhibe la actividad de ARNasa de enzimas eucariotas comunes como ARNasa A, ARNasa B y ARNasa C.

Se suministra con 20 mM de Hepes-KOH (pH 7,6), 50 mM de KCl, 8 mM de agente reductor y 50 % (v/v) de glicerol. Es estable hasta 58 °C y con un rango de concentración mínimo de DTT de 0,5 a 1 mM.

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para inhibir la actividad de 5 ng de ARNasa A en un 50%.

Actuación

Ensayo: Especificación
Pureza: >90%
Contaminación por ARNasa: No se detectó ninguna
Contaminación latente por ARNasa: No se detectó ninguna
Contaminación por exonucleasa: No se detectó ninguna
Contaminación por endonucleasas: No se detectó ninguna

Principio

El inhibidor de ARNasa Hu inhibe las ARNasas mediante unión no covalente en una proporción 1:1 con una interacción proteína-proteína de alta afinidad, formando uno de los complejos biomoleculares más compactos conocidos. Esta actividad contribuye eficazmente al mantenimiento de la integridad del ARN y a la obtención de la cantidad y calidad adecuadas de ARN.

La enzima se utiliza en aplicaciones donde la presencia de ARNasas supone un riesgo sustancial para la obtención de datos de buena calidad, fiables y reproducibles, por ejemplo, en el aislamiento de ARN, la síntesis de ADNc, la RT-PCR, la transcripción y traducción in vitro o la preparación de anticuerpos monoclonales sin ARNasa [1-6]. Es compatible con numerosos reactivos, incluidas las ADN polimerasas y la transcriptasa inversa AMV o M-MuLV, y su adición a la reacción no afecta a la eficiencia de otros componentes.

Procedimiento

La concentración final óptima del inhibidor de ARNasa Hu en una reacción depende del nivel de contaminación por ARNasa, el tiempo de incubación y los compuestos presentes en la mezcla de reacción. Se encuentra en un rango de 1 a 2 U/μL.
- Para una reacción de transcripción inversa estándar, utilice 1 μL (40 U) del inhibidor de ARNasa Hu para un volumen de muestra final de 20 μL.
- Una concentración final de DTT de 0,5 a 1 mM es esencial para una actividad óptima.
- Durante el montaje de la reacción, la enzima debe agregarse antes que otros componentes que sean posibles fuentes de contaminación por ARNasa.
- El uso del inhibidor de ARNasa Hu no excluye el tratamiento con ARNasa H después de la amplificación de la primera cadena de ADNc.

Control de calidad

La pureza de la proteína se determina mediante un ensayo de electroforesis SDS-PAGE que da como resultado una pureza >90%.

La contaminación por ARNasa se evalúa mediante la determinación de su actividad mediante la incubación de 1 µg de ARN con un mínimo de 200 U del inhibidor de ARNasa durante 1 hora a 37 °C. Los resultados se visualizan en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.

La contaminación por ARNasa latente se evalúa mediante la determinación de su actividad mediante la incubación de 1 µg de ARN con un mínimo de 200 U de inhibidor de ARNasa inactivado por calor durante 1 hora a 37 °C. Los resultados se visualizan en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.

La actividad endonucleasa se determina incubando 1 µg de ADN plasmídico superenrollado con un mínimo de 200 U del inhibidor de ARNasa durante 2 horas a 37 °C. Los resultados se visualizan en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. La actividad exonucleasa se determina incubando 1 µg de ADN plasmídico digerido con un mínimo de 200 U del inhibidor de ARNasa Lyo-ready durante 2 horas a 37 °C. Los resultados se visualizan en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.

Uso

Aplicaciones

- Diagnóstico molecular relacionado con el ARN
- Aislamiento y purificación de ARN
- Síntesis de ADNc, RT-PCR, RT-qPCR
- transcripción y traducción in vitro
- Preparación de anticuerpos monoclonales libres de ARNasa

Esto se utiliza en aplicaciones para superar los desafíos de inhibir la presencia de ARNasas ubicuas, que se encuentran comúnmente en la piel, el polvo, los reactivos y las muestras biológicas, como: