Qiagen, V16000128, Kit principal Verogen ForenSeq (384)

Incluye todos los reactivos necesarios para 384 reacciones para preparar bibliotecas de secuenciación que generen datos para el trabajo de casos convencional y pruebas confirmatorias de genealogía genética forense.

Características

- La mayor combinación de STR establecidos en una amplificación
- Cumple con los requisitos mínimos de haplotipo Y europeos/SWGDAM, CODIS, Interpol y ESS
- Perfiles completos a partir de una entrada baja de ADN genómico
- Detecta alelos de muestras desafiantes con un equilibrio superior y altas tasas de llamadas
- Secuenciar simultáneamente 96 muestras por ejecución
- Aprobado para cargar en el Sistema Nacional de Índice de ADN (NDIS) para trabajo de casos (no SE)

Detalles del producto

Identifique los principales STR autosómicos y Y-STR con la línea de productos ForenSeq MainstAY, la forma más accesible de generar datos altamente discriminantes para el trabajo de casos general y las pruebas confirmatorias de genealogía genética forense. Elija entre dos opciones geográficamente relevantes: el kit ForenSeq MainstAY, aprobado por el NDIS y diseñado específicamente para admitir la mayoría de las cargas de STR a bases de datos nacionales, o el kit ForenSeq MainstAY SE, que incluye el marcador SE33 altamente polimórfico. Al centrarse en STR establecidos utilizados en aplicaciones rutinarias de identificación humana y mantener la compatibilidad con bases de datos globales, los productos MainstAY facilitan la transición a la secuenciación de nueva generación. El flujo de trabajo familiar y probado de ForenSeq genera perfiles de ADN más completos para hasta 96 muestras de evidencia en menos de 2 horas de tiempo de práctica.

Actuación

STR autosómicos: Y-STR
D1S1656 vWA CSF1PO SE33* D20S482: DYF387S1 DYS43 DYS393 DYS570
TPOX D12S391 D6S1043 D21S11: DYS19 DYS448 DYS437 DYS576
D2S441 D13S317 D7S820 PentaD: DYS385a-b DYS460 DYS438 DYS612
D2S1338 PentaE D8S1179 D22S1045: DYS389I DYS481 DYS635 Y-GATA-H4
D3S1358 D16S539 D9S1122 TH01: DYS389II DYS505 DYS643
D4S2408 D17S1301: DYS390 DYS522
FGA D18S51: DYS391 DYS533
D5S818 D19S433 D10S1248: DYS392 DYS549
Amelogenina

Característica: Detalles
Recomendación de entrada de ADN: 1 ng por muestra de ADNg, hisopos bucales, tarjeta FTA; 1,2 mm por muestra de la perforación de la tarjeta FTA
Configuración del kit: kit de 96 reacciones y kit de 384 reacciones
Capacidad de multiplexación recomendada: 8–96 muestras por ejecución
Capacidad de multiplexación de locus: análisis simultáneo de 52 marcadores genéticos
Contenido de la mezcla de cebadores: 27 STR autosómicos globales, incluidos CODIS y el conjunto estándar europeo; 25 Y-STR, incluido el conjunto mínimo para la base de datos de referencia de haplotipos Y (YHRD)
Tamaño del amplicón: Media: 235 pb; Máximo: 481 pb
Detección de mezcla de bajo nivel: detecta contribuyentes menores al 5 %
Tiempo total de preparación: Biblioteca: 7 horas y 15 minutos; Práctica: 1 hora y 30 minutos
Tiempo total de secuenciación: aproximadamente 28 horas con el kit de reactivos MiSeq FGx; aproximadamente 22 horas con el kit de reactivos MiSeq FGx Micro

- La combinación de loci STR y amelogenina es una herramienta eficaz para la identificación humana
- Mantiene la compatibilidad con bases de datos existentes en todo el mundo.
- Las recomendaciones de entrada bajas de 1 ng de ADNg proporcionan una tasa de llamada reproduciblemente alta
- Analice datos de secuencia en una interfaz familiar y fácil de usar con el módulo de análisis MainstAY
- Generar informes en menos de 1,5 días

ForenSeq MainstAY ofrece una transición sencilla para incorporar la secuenciación de nueva generación (NGS) a su flujo de trabajo operativo. La NGS permite la tipificación simultánea de varias categorías de STR en una sola reacción, lo que permite recuperar la máxima información de una muestra forense. Además, combina el poder discriminatorio de los STR con variación adicional a nivel de secuencia, lo que permite resolver isoalelos dentro de un STR. El kit ForenSeq MainstAY contiene reactivos para amplificar 27 loci autosómicos y 25 Y-STR como pequeños amplicones y generar datos de secuenciación en el sistema de secuenciación MiSeq FGx mediante el kit de reactivos MiSeq FGx Reagent Micro. Con este flujo de trabajo, se pueden identificar tanto el polimorfismo de secuencia como el de longitud alélica en los Au-STR y los Y-STR en una sola amplificación. Esto elimina la necesidad de ejecutar múltiples flujos de trabajo y maximiza el valor informativo de una muestra forense, aumentando así el poder estadístico de la inclusión. NGS también elimina el problema de los alelos superpuestos, lo que permite a los usuarios interrogar más alelos en el multiplex.

La inclusión de 27 Au-STR, 25 Y-STR y amelogenina en una sola reacción proporciona una razón de verosimilitud esperada (RPE) mayor que la de la mayoría de los kits de STR autosómicos disponibles comercialmente y permite la comparación directa de perfiles de una sola fuente (p. ej., en búsquedas en bases de datos e intercambio de datos internacionales), independientemente del ensayo utilizado para tipificar la muestra comparativa. El perfil genético generado por ForenSeq MainstAY permite la búsqueda de casos con Au-STR, así como la búsqueda de haplotipos con una base de datos de Y-STR. Los Y-STR generan un perfil haplotípico a partir del ADN masculino, lo que los hace extremadamente útiles al trabajar con mezclas de machos y hembras. En presencia de un solo contribuyente masculino, puede utilizarse para excluir posibles contribuyentes masculinos.

El número máximo de bibliotecas que se pueden secuenciar simultáneamente depende del número de lecturas o de la profundidad de cobertura (DoC) deseada por locus. Una cobertura de lectura equilibrada entre amplicones también es crucial para la recuperación de locus y alelos. El kit ForenSeq MainstAY cuenta con un pequeño número de marcadores multiplexados en una única reacción de secuenciación, lo que resulta en una alta cobertura general. El equilibrio interlocus se determinó utilizando bibliotecas MainstAY a partir de 1 ng de ADN de entrada de 46 muestras de Coriell macho, incluyendo un control positivo de amplificación, 49 muestras de Coriell hembra y un NTC. La cobertura promedio de los Au-STR y los Y-STR para las muestras macho fue de 669 y 469 lecturas, respectivamente. La cobertura promedio de los Au-STR para las muestras hembra fue de 1065 lecturas. La diferencia de pliegues entre los Au-STR con mayor y menor profundidad de cobertura fue de 15x, mientras que la diferencia de pliegues entre los Y-STR con las lecturas más altas y más bajas fue de 4,6x (véase la figura "DdC promedio para los marcadores incluidos en el kit ForenSeq MainstAY"). La mediana del balance interlocus para las muestras masculinas, expresada como porcentaje del total de lecturas, fue del 1,9 % (Au-STR: 2,2 % e Y-STR: 1,6 %). Para las muestras femeninas, el balance interlocus para los Au-STR fue del 3,7 % (véase la figura "Balance interlocus para los marcadores genéticos incluidos en el kit ForenSeq MainstAY").

El balance intralocus (ILB) o balance heterocigoto (HB) se calculó como una razón del menor número de lecturas de alelos al mayor número de lecturas de alelos para un par heterocigoto. En comparación con los STR basados ​​en CE, NGS muestra un rango más amplio para el ILB debido a sesgos de amplificación para amplicones más pequeños durante la preparación y secuenciación de la biblioteca. El ILB para heterocigotos y pares de genotipos isométricos se evaluó utilizando las muestras de ADN de 1 ng en este estudio para cada muestra y locus. Todos los marcadores en el panel exhibieron valores de ILB superiores al 60% con una mediana de ILB del 86%. La cobertura y la baja variación del kit ForenSeq MainstAY indican que los amplicones están bien equilibrados, lo que reduce la probabilidad de pérdida de locus o alelos y mejora la identificación de contribuyentes menores en una mezcla (ver figura "Balance intralocus para marcadores genéticos incluidos en el kit ForenSeq MainstAY con entrada de ADN de 1 ng").

Se evaluó la capacidad de generar genotipos y haplotipos a partir de una variedad de entradas utilizando ADNg diluido en serie en cantidades de plantilla de 1 ng, 500 pg, 250 pg, 125 pg, 62,5 pg, 31,25 pg, 15,625 pg y 7,82 pg, por triplicado. Se secuenciaron simultáneamente 96 bibliotecas con el kit MiSeq FGx Reagent Micro. El kit ForenSeq MainstAY ofrece una alta sensibilidad, generando perfiles completos (sin pérdida de alelos) y una tasa de llamada del 100 % con tan solo 62,5 pg de ADN de entrada al secuenciar simultáneamente 96 bibliotecas. Para determinar la tasa de identificación de alelos y la precisión comparativa de los datos de genotipo basados ​​en secuenciación, se generaron genotipos y haplotipos con el módulo de análisis MainstAY del software Universal Analysis, utilizando la configuración predeterminada, y se compararon con datos de genotipado ortogonal obtenidos mediante métodos convencionales (detección de la longitud de fragmentos CE para STR). Los Au-STR mostraron una concordancia del 100 % hasta 62,5 pg, con una concordancia del 95 % incluso a 31 pg. Los Y-STR mostraron una concordancia del 100 % hasta 125 pg, con una concordancia del 91 % hasta 31 pg. Todas las identificaciones discordantes se debieron a una distorsión que excedió el filtro de distorsión predeterminado establecido para muestras de 1 ng. (Véase la figura «Estudio de sensibilidad con muestras de ADNg diluidas en serie y amplificadas por triplicado»).

Para evaluar la concordancia de los genotipos y haplotipos generados por el kit ForenSeq MainstAY, se prepararon y secuenciaron por triplicado 31 bibliotecas que incluían los estándares NIST SRM 2391d, ADN de Coriell, un control positivo de amplificación y tres NTC. Los datos se analizaron utilizando el módulo de análisis MainstAY en Universal Analysis Software con umbrales de análisis predeterminados y filtros de tartamudeo. La precisión de los genotipos y alelos de los haplotipos se determinó comparándolos con datos CE ortogonales. La precisión y las tasas de llamada se determinaron utilizando experimentos de repetibilidad y reproducibilidad donde se prepararon y secuenciaron bibliotecas a partir de 15 muestras de ADN de control por cuadruplicado con un control positivo de amplificación y tres NTC por tres operadores en tres instrumentos MiSeq FGx diferentes. Se observó alta precisión en Au-STR (99,82 %) e Y-STR (100 %). Se detectaron seis alelos discordantes de 3261 alelos Au-STR. No se detectaron alelos discordantes para los 774 alelos Y-STR. De igual manera, se observaron altas tasas de precisión del 99,87 % y el 99,42 % para los Au-STR y los Y-STR, respectivamente. Todas las discrepancias se atribuyeron a alelos con discordancia que excedían los filtros de discordancia predeterminados.

Para evaluar la capacidad del kit ForenSeq MainstAY de detectar alelos menores en contribuyentes de bajo nivel, se generaron mezclas de muestras de control femeninas y masculinas a 1 ng, con la muestra femenina como el contribuyente principal. El porcentaje del contribuyente menor en la mezcla osciló entre el 50% y el 0,2%. El número de alelos contribuyentes de alelos menores únicos y no compartidos en la mezcla se evaluó utilizando los umbrales analíticos y de interpretación predeterminados, así como los filtros de tartamudeo en el módulo de análisis MainstAY en el software de análisis universal (véase la figura "Mezclas de muestras de control de ADNg femenino:masculino a niveles de dilución seriada del contribuyente menor"). Con un contribuyente menor del 50%, se detectaron 31 alelos autosómicos menores únicos y 27 alelos Y. Aproximadamente 15 alelos autosómicos menores únicos (50% de alelos Au-STR únicos) y 26 alelos Y fueron detectables con una contribución menor del 5%. Con una contribución menor del 1%, se detectaron más de 10 loci Y-STR. ForenSeq MainstAY permite la identificación eficiente de contribuyentes menores en una mezcla, incluso con contribuciones bajas.

La capacidad de tipificar genotipos y haplotipos de muestras de ADN degradado con el flujo de trabajo MainstAY de ForenSeq se evaluó utilizando ADNg parcialmente degradado que imita muestras forenses expuestas a estrés ambiental y químico. Se prepararon y secuenciaron bibliotecas de 1 ng de sangre degradada de 30 muestras, 1 control de amplificación positivo y NTC, por triplicado, utilizando el kit Miseq FGx Reagent Micro. El índice de degradación (ID) se utilizó para evaluar la calidad de la muestra de las bibliotecas. Las muestras con un ID de 1 a 4 se consideraron no degradadas, las muestras con un ID de 4 a 10 se consideraron moderadamente degradadas y aquellas con un ID >10 se consideraron severamente degradadas. Las muestras analizadas con MainstAY tuvieron un ID que varió de 1 a 56, abarcando muestras de degradación baja, moderada y alta. Todos los STR se tipificaron con precisión en muestras sin degradación. Las muestras con degradación moderada mostraron una tasa de llamada de STR tipificados con precisión superior al 85%, mientras que las muestras con degradación severa tuvieron una tasa de llamada superior al 71%, lo que indica una pérdida mínima de STR amplificables. La muestra con el mayor índice de degradación (ID) de 56 mostró una recuperación del 60% de alelos (40 de 74). ForenSeq MainstAY permite la detección de un gran número de alelos incluso en muestras con degradación severa (véase la figura «ADN genómico extraído de muestras de sangre degradadas»).

Principio

El flujo de trabajo ForenSeq MainstAY se basa en la química ForenSeq habitual que sustenta el portafolio de preparación de bibliotecas de Verogen. Este sensible ensayo basado en PCR amplifica eficientemente 53 marcadores con Índices Duales Únicos (UDI) integrados, generando amplicones cortos que aumentan la probabilidad de detectar alelos en ADN degradado. Un volumen de entrada de extracto de ADN de 8 μl ofrece flexibilidad para muestras de baja concentración y la dilución de muestras inhibidas.

Esta solución completa incluye un control de amplificación positivo, lo que facilita su adquisición y calibración. El kit permite la secuenciación y el análisis de hasta 96 muestras con el kit de reactivos MiSeq FGx Micro, utilizando la capacidad de lectura de extremo emparejado largo del sistema de secuenciación MiSeq FGx, lo que maximiza el rendimiento de las muestras y minimiza el coste por muestra. La recomendación de un aporte de ADNg bajo de 1 ng permite la recuperación fiable y reproducible de perfiles completos desde muestras de alta calidad de una sola fuente hasta muestras complejas de 62,5 pg.

Procedimiento

El kit ForenSeq MainstAY permite un flujo de trabajo integral en menos de 30 horas al utilizarse junto con el sistema de secuenciación MiSeq FGx, el microkit de reactivos MiSeq FGx y el módulo de análisis MainstAY del software de análisis universal (UAS). El módulo de análisis MainstAY ofrece exploración guiada, visualización completa con vistas de proyectos y muestras, y revisiones meticulosas de las llamadas de alelos STR con amplias funciones de filtrado y clasificación. Además, genera informes legibles que se pueden exportar a múltiples formatos. Este flujo de trabajo integrado proporciona una vía de acceso rentable para los laboratorios que consideran la NGS para aplicaciones forenses.

El flujo de trabajo incluye cinco puntos de parada seguros y una placa adaptadora premezclada que facilita y optimiza la preparación de la biblioteca. Es compatible con diversas fuentes comunes de ADN forense, como ADNg extraído, lisados ​​crudos y perforaciones de tarjetas de medios de almacenamiento, como FTA.

Aplicaciones

- Análisis enfocado y eficiente para casos de gran volumen

- Mejores datos, coste similar

- Totalmente integrado y soportado

Analice simultáneamente la mayor colección de loci bien caracterizados, incluyendo 27 STR autosómicos y 25 marcadores Y-STR, para hasta 96 muestras. Genere perfiles balanceados compatibles con todas las bases de datos de STR existentes con tan solo 100 pg. Analice datos eficientemente con un módulo de análisis de interacción mínimo y elija entre una gama de opciones de exportación listas para cargar, compatibles con los requisitos de las bases de datos regionales.

Obtenga datos altamente discriminantes para los loci STR principales de CODIS y del Conjunto de Estándares Europeos (ESS) en una sola sesión de amplificación y secuenciación a un coste comparable al del análisis CE tradicional. Descubra el potencial de la secuenciación de última generación, independientemente de sus necesidades de rendimiento, con dos tamaños de kit de secuenciación disponibles.

El flujo de trabajo integral se basa en el proceso ForenSeq, lo que permite una amplia gama de análisis de ADN en una única plataforma de eficacia probada. El kit ForenSeq MainstAY se integra perfectamente con UAS para una rápida evaluación de datos y la generación de informes con un solo clic.