Qiagen, X8010L, Exonucleasa I (30.000 U)

30.000 U de exonucleasa I (1,5 mL a 20.000 U/mL)

Características

- Escinde bases en ADN monocatenario en dirección 3ʹ→ 5ʹ
- Elimina el ADN monocatenario lineal, dejando ADN bicatenario en la muestra.

Detalles del producto

La exonucleasa I escinde el ADN monocatenario en dirección 3ʹ→5ʹ, liberando mono/dinucleótidos 5ʹ y dejando intactas las moléculas de ADN bicatenario y el extremo 5ʹ. La enzima es procesiva, aunque la digestión se ve inhibida por un fosfato en el extremo 3ʹ. La exonucleasa I tolera una amplia gama de condiciones de tampón y suele añadirse a reacciones que contienen magnesio (1–3).

Esta enzima se suministra en 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA y 50% glicerol: pH 7,5 a 25°C.

Actuación

Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Endonucleasa bicatenaria: 200 U
Contaminación por ADN de E. coli: 200 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 54.500 Daltons

Principio

La proteína es producida por una cepa de E. coli que expresa el gen Exonucleasa I recombinante.

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para producir 10 nmol de nucleótido total soluble en ácido en 30 minutos a 37 °C.

Procedimiento

- Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 20 µL: 5 µL de producto de PCR 10 unidades de Exonucleasa I (X8010L)
- 5 µL de producto de PCR
- 10 unidades de Exonucleasa I (X8010L)
- Incubar la mezcla de reacción a 37°C durante 15 minutos.
- Inactivar la enzima por calor a 80°C durante 15 minutos.

- 5 µL de producto de PCR
- 10 unidades de Exonucleasa I (X8010L)

- La exonucleasa I degradará preferentemente los cebadores de oligonucleótidos monocatenarios en una reacción que contenga productos de amplificación u otras fuentes de ADN bicatenario, dejando intactas las moléculas bicatenarias.
- La exonucleasa I, combinada con la exonucleasa Lambda (X8030L), elimina eficazmente las especies de ADN lineal de las preparaciones de plásmidos.
- La exonucleasa I funciona bien en la mayoría de los tampones de biología molecular que contienen magnesio superior a 1,5 mM.

Instrucciones de uso

Eliminación de ADN monocatenario de los productos de PCR

Notas:

Referencias:

1. Lehman, IR y Nussbaum, AL (1964) J. Biol. Chem., 239, 2628. 2. Kushner, SR y col. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 824. 3. Kushner, SR y col. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 1366.

Control de calidad

La actividad de la unidad se midió utilizando un método de dilución seriada doble.

Se realizaron diluciones de la enzima en una solución de almacenamiento de exonucleasa I con glicerol (50%) y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían un fragmento de ADN tritiado monocatenario y 67 mM de glicina-KOH (pH 9,5), 10 mM de DTT y 6,7 mM de MgCl₂. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se colocaron en hielo y se analizaron mediante un método de precipitación con TCA.

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Limpieza de la preparación del plásmido
- Elimina ssDNA de una mezcla de ssDNA lineal y dsDNA
- Elimina los cebadores de oligonucleótidos después de la PCR

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: