Product Description
50.000 U de exonucleasa III (100.000 U/ml) (0,5 ml) y tampón amarillo 10X (1 x 1,5 ml)
Características
- La acción de la exonucleasa extirpa las bases del ADN dúplex en dirección 3'→5'
- Enzima multifuncional con actividades de fosfatasa, exonucleasa, AP endonucleasa y ARNasa H
Detalles del producto
La exonucleasa III es una exonucleasa 3′→5′ que actúa digiriendo una hebra de un dúplex de dsADN a la vez o digiriendo la hebra de ARN de un heterodúplex de ARN-ADN. La exonucleasa III elimina un número limitado de nucleótidos por cada unión, lo que resulta en deleciones progresivas coordinadas dentro de la población de moléculas de ADN. La exonucleasa III elimina los grupos terminales 3′ del dsADN, degrada eficazmente los extremos de ADN hundidos en 3′, pero no los salientes en 3′ (creando salientes 5′), rompe los enlaces fosfodiéster en el lado 5′ de los sitios AP tanto en dsADN como en ssADN y aumenta el recambio de la ADN glicosilasa MutY.
La enzima se suministra en 25 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50% glicerol; pH 8,0 a 25 °C.
La enzima se suministra con tampón amarillo 10X (B0130) que contiene 100 mM de Bis-Tris-Propano-HCl, 100 mM de MgCl 2 , 10 mM de DTT; pH 7,0 a 25 °C.
La exonucleasa 3'→5' se puede inactivar calentándola a 65 °C durante 5 minutos.
Actuación
Ensayo: Especificación
Pureza: >99%
Actividad específica: 100.000 U/mg
Endonucleasa bicatenaria: 1000 U = Sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 1000 U <10 copias
Actividad de UDG: <20 U/mL
Principio
La mayoría de las endonucleasas y exonucleasas han evolucionado como enzimas independientes, pero algunas enzimas han evolucionado con ambas actividades. La exonucleasa III de E. coli es una nucleasa multifuncional que realiza actividades de endonucleasa específica del sitio AP y de exonucleasa 3′→5′.
La actividad exodesoxirribonucleasa 3'→5' de la Exonucleasa III es específica para el ADN bicatenario. La Exonucleasa III degrada el ADN bicatenario de extremos romos, salientes 5' o mellas, libera mononucleótidos 5' de los extremos 3' de las cadenas de ADN y produce fragmentos de ADN monocatenario. No es activa en los extremos salientes 3' del ADN que tienen al menos cuatro bases de longitud y no contienen un residuo C en el extremo 3' del ADN monocatenario. La enzima no es activa en nucleótidos con enlaces fosforotioato.
La actividad de la exonucleasa III ARNasa H degrada exonucleolíticamente la cadena de ARN en híbridos ARN-ADN. La actividad de la exonucleasa III 3'-fosfatasa elimina el fosfato 3'-terminal, generando un grupo 3'-OH.
Procedimiento
Las instrucciones para el uso de Exonucleasa III se proporcionan en el protocolo del kit correspondiente en los recursos a continuación.
Control de calidad
La actividad de la Unidad de Exonucleasa III se midió mediante dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción 1X y se añadieron a reacciones de 50 μL que contenían un fragmento de ADN tritiado y tampón amarillo Exo III 1X. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se sumergieron en hielo y se analizaron mediante precipitación con TCA.
La concentración de proteína de Exonucleasa III (OD 280) se determinó mediante la absorbancia de OD 280.
La pureza física de la exonucleasa III se evaluó mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evaluó comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.
La actividad de endonucleasa bicatenaria en la enzima exonucleasa III se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 0,5 μg de ADN plasmídico y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La contaminación de la exonucleasa III por E. coli se evaluó utilizando muestras replicadas de 5 μl de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.
La contaminación de la exonucleasa III por ADN glicosilasa de uracilo (UDG) se evaluó en una reacción de 50 μL que contenía ADN de uracilo tritiado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 60 minutos a 37 °C en condiciones estándar de caracterización de la unidad UDG.
Aplicaciones
- Análisis de la interacción ADN-proteína mediante huella de ADN Exo III
- Producción de deleciones anidadas en ADN bicatenario
- Ensamblaje de ADN basado en homología enzimática a través de SENAX (mezcla de ensamblaje de exonucleasas estelares)
- Clonación de productos de PCR
- Preparación de ADN monocatenario para secuenciación didesoxi
- Mutagénesis dirigida al sitio
- Preparación de sondas específicas de la cadena
Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:
Order Guidelines
1. Price & Stock Available on Request. Click to send email to: service@iright.com
2. Please DO NOT make payment before confirmation.
3. Minimum order value of $1,000 USD required.
Collaboration
Tony Tang
Email: Tony.Tang@iright.com
Mobile/WhatsApp/Wechat: +86-17717886924