Qiagen, X8030L, Exonucleasa Lambda (10.000 U)

10 000 U (paquete de evaluación) de exonucleasa Lambda (2,0 ml a 5000 U/ml) y tampón de reacción Lambda Exo 10X (1 x 1,5 ml).

Características

- Exonucleasa 5ʹ→ 3ʹ altamente procesiva, activa en extremos romos y hundidos en 5'

Detalles del producto

La exonucleasa lambda es una exonucleasa bicatenaria 5ʹ→3ʹ altamente procesiva que degrada una hebra del dúplex. Puede iniciar ADN romo o ADN con salientes monocatenarios 3ʹ. Presenta una actividad muy reducida en ADN no fosforilado, ADN monocatenario y ADN con extremos monocatenarios 5ʹ salientes. No inicia ADN en una muesca o un hueco (1,2).

Se suministra en: Lambda Exonuclease se suministra en 25 mM Tris·Cl, 50 mM NaCl, 1,0 mM DTT, 0,1 mM EDTA y 50 % de glicerol: pH 7,5 a 25 °C.

Se suministra con: tampón de reacción Lambda Exo 10X (n.º de cat. B8030) que contiene 670 mM de glicina y 25 mM de MgCl 2 , pH 9,4 a 25 °C.

Actuación

Prueba: Cantidad analizada
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Endonucleasa bicatenaria: 1500 U
Contaminación por ADN de E. coli: 1500 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 25,909 Dalton

Principio

La proteína es producida por una cepa de E. coli que sobreexpresa el gen de la exonucleasa del bacteriófago Lambda.

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para producir 10 nmol de desoxirribonucleótido soluble en ácido a partir de un sustrato bicatenario en 30 minutos a 37 °C.

Procedimiento

Componentes: Concentración final
Agua libre de nucleasas: N/A
Tampón de reacción Lambda Exo 10X (B8030): 1X
ADN: hasta 5 µg
Exonucleasa Lambda (X8030L): 5 U
Volumen total = 50 µL

Instrucciones de uso Digestión de la cadena fosforilada 5' de dsADN.

1. Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 50 µL:

2. Incubar a 37 °C durante 30 minutos. 3. La reacción se puede detener agregando 10 mM de EDTA o incubando a 75 °C durante 10 minutos.

Control de calidad

La actividad unitaria se mide mediante un método de dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción 1X y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían un fragmento de ADN tritiado de 1,1 kb y tampón de reacción Lambda Exo 1X. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se sumergieron en hielo y se analizaron mediante un método de precipitación con TCA.

La concentración de proteína (OD 280) se determina mediante la absorbancia de OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por ADNr 16S de E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan.

Aplicaciones

- Limpieza de la preparación de plásmidos
- Genera ADN monocatenario a partir de ADN bicatenario lineal.
- Elimina los cebadores de oligonucleótidos después de la PCR

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias: 1. Ausubel, FM et al. (1987) Protocolos actuales en biología molecular (John Wiley and Sons, Inc.) 2. Little, JW (1981) Gene Amp. Anal., 2, 135-145.