Product Description
1,5 mg de proteína de unión a ADN monocatenario de E. coli (0,5 mL a 2,75 mg/mL)
Características
- Se une al ADN monocatenario
- Relaja la estructura secundaria del ADN y mejora la procesividad en ciertas reacciones mediadas por la ADN polimerasa.
Detalles del producto
La proteína de unión al ADN monocatenario de E. coli se une preferentemente al ADN monocatenario, formando un tetrámero de cuatro subunidades idénticas de 18,9 kDa, que protege de 8 a 16 nucleótidos. Esta proteína no se une bien al ADN bicatenario. En la naturaleza, participa en la replicación, recombinación y reparación del ADN. In vitro, se ha observado que la proteína de unión al ADN monocatenario de E. coli estimula reacciones específicas mediadas por la ADN polimerasa al relajar la estructura secundaria del ADN y mejorar la procesividad enzimática.
Esta enzima se suministra en 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1,0 mM DTT, 0,1 mM EDTA y 50% glicerol; pH 7,5 a 25 °C.
Actuación
Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 25 µg
Exonucleasa bicatenaria: 25 µg
Endonucleasa bicatenaria: 25 µg
Contaminación del ADN por E. coli: n/d
- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 18.975 Daltons
Principio
La proteína enzimática recombinante es producida por una cepa de E. coli recombinante que porta el gen de E. coli para la proteína de unión al ADN monocatenario.
Procedimiento
- Meyer, RR y Laine, PS (1990) Microb. Rev., p342-380.
- Krauss, G. et al. (1981) Bioquímica., 20, 5346-52.
- Weiner, JH y otros (1975) J. Biol. Chem., 250, 1972-80.
- Chou, Q. (1992) Nuc. Acids. Res., 20(16), 4371.
- Rapley, R. (1994) Mol. Biotecnología, 2, 295-298.
Instrucciones de uso
La SSB de E. coli es una proteína de unión a ADN monocatenario (SSB) que se puede utilizar para estabilizar regiones de ADN monocatenario y mejorar la fidelidad y la procesividad de la ADN polimerasa en la PCR (1,5).
La proteína también se puede utilizar para minimizar el artefacto de mutagénesis por deleción durante la PCR mediada por la ADN polimerasa Taq (4), mejorar el rendimiento de la amplificación del ADN y permitir la secuenciación de plantillas de ADN problemáticas, por ejemplo, regiones con fuertes estructuras secundarias (5).
Como punto de partida en las reacciones de PCR mediadas por SSB, agregue proteína SSB de E. coli en un rango de concentración entre 20 y 320 ng/μL por cada 50 µL de reacción para identificar la concentración óptima.
Referencias:
Control de calidad
La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.
La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.
La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La capacidad de unión del ADN monocatenario se confirmó mediante un ensayo de inhibición de PCR añadiendo cantidades decrecientes de proteína de unión a SDNA monocatenario de E. coli a una serie de amplificaciones por PCR que contenían ADN diana, 200 µM de dNTP, tampón de PCR 1X y Taq ADN polimerasa. Las reacciones se incubaron en un termociclador y se sometieron a 25 ciclos de PCR. Las muestras se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se registró la cantidad necesaria para bloquear el 100 % de la acumulación del producto de PCR. Criterios de aceptación del ensayo: Se necesitan 0,70 µg de proteína de unión a SDNA monocatenario de E. coli para inhibir la amplificación por PCR de 5 ng de ADN diana tras 25 ciclos de PCR.
Aplicaciones
- Mejora de la fidelidad de la ADN polimerasa
- Secuestro de cebadores
- Permite longitudes de lectura más largas en la pirosecuenciación para el análisis de SNP
Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:
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