Product Description
10 000 U de polinucleótido quinasa T4 (1,0 ml a 10 000 U/ml) y tampón de polinucleótido quinasa 10X (2 x 1,5 ml)
Características
- Incorpora fosfatos marcados en el extremo 5' de los ácidos nucleicos.
- Cataliza la transferencia e intercambio de fosfato al 5′-OH de ssDNA y RNA
- Cataliza la transferencia e intercambio de fosfato al 5′-OH del dsADN.
- Elimina los grupos fosforilo 3' del ADN y ARN o de un nucleótido/nucleósido
Detalles del producto
La polinucleótido quinasa T4 (PNK) se utiliza ampliamente para fosforilar el extremo 5' del ADN y el ARN en experimentos de marcaje y ligación. La PNK T4 cataliza la transferencia e intercambio del fosfato en la posición gamma terminal del ATP al extremo 5'-hidroxilo de moléculas de ADN, ARN y nucleósido 3'-monofosfato, tanto monocatenarias como bicatenarias.
T4 PNK también cataliza la eliminación hidrolítica de los extremos 3'-PO4 del ADN, ARN y desoxinucleósidos 3'-monofosfatos. Esta enzima se utiliza para eliminar los grupos 3'-fosforilo de nucleótidos/nucleósidos o ADN y ARN en estudios de expresión y función génica.
Además de su importancia en la investigación de biología molecular y bioquímica, T4 PNK ejemplifica una familia de enzimas bifuncionales con actividades 5′-quinasa y 3′-fosfatasa que desempeñan papeles clave en la reparación del ARN y el ADN.
La enzima se suministra en 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 0,1 µM ATP, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50% glicerol; pH 7,4 a 25 °C.
La enzima se suministra con un tampón PNK 10X (B9040) que contiene 700 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl 2 , 50 mM DTT; pH 7,6 a 25 °C.
Actuación
Prueba: Especificación
Pureza: >99%
Actividad específica: 133.333 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: 2000 U <5,0 % liberada
Exonucleasa bicatenaria: 2000 U <1,0 % liberada
Endonucleasa bicatenaria: 2000 U = Sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 2000 U; <10 copias
Principio
La polinucleótido quinasa T4 (PNK) cataliza la transferencia e intercambio del fosfato en la posición gamma terminal del ATP al extremo 5'-hidroxilo de moléculas de ADN, ARN y nucleósido 3'-monofosfato, tanto monocatenarias como bicatenarias. La PNK T4 también exhibe actividad 3'-fosfatasa y 2', 3'-fosfodiesterasa cíclica.
Procedimiento
Las instrucciones para el uso de la polinucleótido quinasa T4 se proporcionan en el protocolo del kit correspondiente en los recursos a continuación.
Control de calidad
La actividad unitaria se midió mediante un método de dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción 1X y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían 10 µM de ADN monocatenario Oligo(dT), tampón de reacción PNK 1X y 66 µM de ATP y [γ₃₂P]-ATP. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a 37 °C, se sumergieron en hielo y se analizaron mediante el método de Sambrook y Russell (Molecular Cloning, v3, 2001, págs. A8.25-A8.26).
La concentración de proteína se determinó mediante la absorbancia OD 280. Se analizó una muestra de 2,0 μL de enzima a OD 280 utilizando un espectrofotómetro estandarizado con una muestra de BSA de 2,0 mg/mL y blanqueada con solución de almacenamiento de producto.
La pureza física se evaluó mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evaluó comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.
La actividad de la exonucleasa monocatenaria se determinó en una reacción de 50 μL con 10.000 cpm de ADN monocatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática. La incubación durante 4 horas a 37 °C resultó en una liberación de menos del 5,0 % de los recuentos solubles en TCA.
La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determinó en una reacción de 50 μL con 5000 cpm de un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática. La incubación durante 4 horas a 37 °C resultó en una liberación de menos del 1,0 % de los recuentos solubles en TCA.
La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determinó en una reacción de 50 μL con 0,5 μg de ADN pBR322 y 10 μL de solución enzimática. Tras 4 horas de incubación a 37 °C, no se observó ninguna conversión a ADN circular mellado, según se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa.
La contaminación por E. coli se evaluó utilizando muestras replicadas de 5 μL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores oligonucleotídicos correspondientes al locus del ARNr 16S.
Aplicaciones
- etiquetado de los extremos 5' del ADN o ARN para su uso como sondas de hibridación en el mapeo de transcripciones con nucleasas en secuenciación
- como sondas de hibridación
- en el mapeo de transcripciones con nucleasas
- en secuenciación
- fosforilar enlaces de oligodesoxirribonucleótidos u otras moléculas de ADN antes de la ligadura
- cebadores de oligodesoxinucleótidos de marcado final para su uso en reacciones de secuenciación
- desfosforilando los extremos 3' del ARN en ausencia de ATP
- en una reacción de intercambio para marcar los extremos 5' de las moléculas de ADN o ARN que tienen fosfatos 5' sin marcar
- como sondas de hibridación
- en el mapeo de transcripciones con nucleasas
- en secuenciación
Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:
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