Qiagen, Y9080L, Endonucleasa VIII (10.000 U)

10.000 U de Endonucleasa VIII (1 mL de 10.000 U/mL) y tampón de Endonucleasa VIII 10x (1 x 1,5 mL).

Características

- Elimina las pirimidinas dañadas del ADN dúplex.
- Escinde los sitios AP dejando fosfatos terminales en los extremos 5ʹ y 3ʹ

Detalles del producto

La endonucleasa VIII de E. coli funciona como N-glicosilasa, eliminando las lesiones oxidativas de bases y generando un sitio AP, y como AP-liasa, escindiendo posteriormente la cadena principal de fosfodiéster y dejando fosfatos terminales en los extremos 5' y 3' (1). Las bases dañadas eliminadas por la endonucleasa VIII incluyen urea, 5,6-dihidroxitimina, timina glicol, 5-hidroxi-5-metilhidantoína, uracil glicol, 6-hidroxi-5,6-dihidramina y metiltartronilurea (2).

Esta enzima se suministra en 10 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0,1 mM EDTA y 50% glicerol; pH 8,0 a 25 °C.

A una temperatura de 25 °C y un pH de 8,0, el tampón 10x para la endonucleasa Vlll comprende 100 mM de Tris-HCl, 750 mM de NaCl y 10 mM de EDTA.

Actuación

Prueba: Cantidad analizada
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 10 U
Endonucleasa bicatenaria: 100 U
Contaminación por ADN de E. coli: 100 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 29.845 Daltons

Principio

La proteína enzimática recombinante es producida por una cepa de E. coli que lleva el gen de la endonucleasa VIII clonado.

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir 1 pmol de un dúplex de oligonucleótidos que contiene un solo sitio AP en 1 hora a 37 °C.

Procedimiento

- Se recomienda utilizar el tampón de reacción de endonucleasa VIII a 1x, pero esta enzima está activa en la mayoría de los tampones de reacción de biología molecular.
- Agregue 0,5 µL de Endonucleasa VIII a una reacción que contenga sustrato de ADN.
- Incubar a 37°C durante 30 minutos.
- La inactivación por calor se puede realizar a 75°C durante 10 minutos.

Instrucciones de uso

Nota: El protocolo se puede modificar para el uso específico de la aplicación.

Control de calidad

La actividad específica de la endonucleasa VIII se midió mediante un método de dilución seriada doble. Se prepararon diluciones de la enzima en su solución de almacenamiento de glicerol y se añadieron a reacciones de 10 µL que contenían 2,0 µM de un oligonucleótido dúplex de 34 bases, marcado con FAM, que contenía un solo uracilo. Cabe destacar que el sustrato se pretrató durante 2 minutos con una unidad de UDG para crear un sitio abásico. Las reacciones se incubaron durante 60 minutos a 37 °C, se colocaron en hielo, se desnaturalizaron con NN-dimetilformamida y se analizaron mediante la aplicación de un gel de acrilamida TBE-urea al 15 % y su exposición a luz UV de onda corta.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Escisión de pirimidinas dañadas del ADN dúplex
- Escisión de sitios AP dejando fosfatos 3ʹ y 5ʹ
- Medición del daño del ADN mediante electroforesis en gel de células individuales o ensayo cometa (3)

- Dizdaroglu, M., et al., (1993) Biochemistry, 32:12105.
- Hatahet, Z., et al. (1994) J. Biol. Química, 269:18814.
- DOI: 10.1385/MB:26:3:249

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias