Qiagen, Y9130L, proteína del gen 32 de T4

1,0 mg de proteína T4 Gen 32 (0,1 mL a 10 mg/mL)

Características

- Estabiliza regiones monocatenarias del ADN.
- Mejora los procedimientos de secuenciación de ADN en regiones ricas en estructura secundaria
- Aumenta la eficiencia de la amplificación por PCR
- Estimula la tasa de síntesis de la ADN polimerasa T4 en sustratos monocatenarios cebados.

Detalles del producto

La proteína nativa Gene 32 del bacteriófago T4 (T4gp32) es una proteína de unión al ADN monocatenario que es necesaria para la replicación, recombinación y reparación del ADN T4.

La proteína T4 Gen 32 ha demostrado mejorar el rendimiento de diversas actividades relacionadas con la síntesis de ADN en regiones ricas en estructura secundaria, como la amplificación por PCR y la secuenciación de ADN. Se pueden lograr mejores rendimientos y calidad de las plantillas mediante el uso de proteínas de unión al ADN en reacciones de amplificación y secuenciación. La proteína T4 Gen 32 también estimula la tasa de síntesis de la ADN polimerasa T4 en sustratos monocatenarios cebados, mostrando un aumento de 5 a 10 veces en la tasa de síntesis.

El producto se suministra en 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 1 mM EDTA, 50% glicerol; pH 8,0 a 25°C.

Actuación

Ensayo: Especificación
Pureza: >99%
Unión del ADN: funcional
Exonucleasa monocatenaria: 100 µg <1,0 % liberado
Exonucleasa bicatenaria: 100 µg <1,0 % liberado
Endonucleasa bicatenaria: 100 µg = Sin conversión
Contaminación de ADN por E. coli: 25 µg <10 copias

Principio

La proteína T4 Gen 32 es una proteína monocatenaria de unión a ácidos nucleicos que estabiliza las regiones monocatenarias del ADN. Su capacidad para mejorar diversas actividades relacionadas con la síntesis de ADN se basa en su función esencial en la replicación del bacteriófago T4.

La gp32 se une transitoriamente y de forma cooperativa a las secuencias molde de ssADN a medida que estas entidades son expuestas por la helicasa procesiva que opera dentro del complejo de replicación. Esta unión proporciona a estas secuencias de ssADN una conformación óptima para la interacción con las ADN polimerasas y otras proteínas de replicación. Al recubrir estas secuencias de ssADN expuestas transitoriamente, la gp32 también las protege de la degradación por nucleasas mientras desempeñan sus funciones de moldeo (y otras) en asociación con las ADN polimerasas de cadena líder y rezagada.

Procedimiento

Las instrucciones para utilizar la proteína T4 Gene 32 se proporcionan en el protocolo del kit correspondiente en los recursos a continuación.

Control de calidad

La unión del ADN monocatenario por la proteína T4 Gen 32 se midió mediante un ensayo de desplazamiento en gel con un oligonucleótido monocatenario marcado con fluorescencia. Se realizaron diluciones seriadas de la enzima en tampón de reacción T4 GP32 1X (50 mM de acetato de potasio, 20 mM de Tris-acetato, 10 mM de acetato de magnesio, 1 mM de DTT; pH 7,9) y se añadieron a reacciones de 10 μL que contenían un sustrato de oligonucleótido marcado con 5'-FAM y tampón de reacción T4 GP32 1X. Las reacciones se incubaron durante 20 minutos a 37 °C, se sumergieron en hielo y se transfirieron a un gel de TBE-urea al 15 %. La capacidad de unión al ADN se observó como un desplazamiento de banda en el peso molecular aparente del oligonucleótido en el gel de TBE-urea.

La concentración de proteína (OD 280) de la proteína del gen 32 T4 se determinó mediante la absorbancia de OD 280.

La pureza física del producto se evaluó mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evaluó comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.

La actividad de exonucleasa monocatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 μL de solución incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 μL de solución de proteína incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de endonucleasa bicatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 0,5 μg de ADN plasmídico y 10 μL de solución de proteína incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evaluó utilizando muestras replicadas de 5 μL de solución de proteína desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Aumentar la eficiencia de enzimas como la Taq ADN polimerasa, la transcriptasa inversa y la telomerasa.
- Promoción de la síntesis de ADN por la ADN polimerasa
- Reducir el efecto de las sustancias inhibidoras en la PCR
- Mejora de la mutagénesis específica del sitio
- Eliminación de bandas adicionales durante la secuenciación
- Marcado de ADN monocatenario para microscopía electrónica

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: