Qiagen, Y9140-HC-L, mezcla de reparación final (alta concentración)

Para 75 reacciones de ADN de alta concentración. Mezcla de reparación final 10X (0,075 mL), tampón de reparación final 10X (1 x 1,5 mL) y solución de dNTP 1 mM (0,5 mL).

Características

- Utiliza las actividades de la polimerasa 5′→3′ y la exonucleasa 3′→5′ de la ADN polimerasa T4
- Incluye la polinucleótido quinasa T4 para 5′-fosforilar los extremos del ADN de extremos romos
- La formulación de baja concentración prepara ≤1 µg de ADN para la ligadura de extremos romos
- La formulación de alta concentración prepara >1 µg de ADN para la ligadura de extremos romos
- El ADN embotado es inmediatamente adecuado para la ligadura mediante la ADN ligasa T4

Detalles del producto

La mezcla de reparación de extremos convierte el ADN con extremos 5' y/o 3' salientes dañados o incompatibles en ADN romo fosforilado en 5'. Esta conversión se logra aprovechando las actividades de la polimerasa 5'→3' y la exonucleasa 3'→5' de la ADN polimerasa T4 (P7080). La polinucleótido quinasa T4 (Y9040) garantiza la fosforilación en 5' de los extremos de los fragmentos de ADN romos para su posterior ligación por la ADN ligasa T4.

La ligadura se puede realizar inmediatamente utilizando la ligasa de ADN T4 rápida (L6030-HC).

La formulación de mezcla reparadora de extremos de baja concentración está optimizada para procedimientos como la clonación general utilizando bajas concentraciones de ADN.

La formulación de mezcla de reparación final de alta concentración está optimizada para procedimientos como la construcción de bibliotecas para la secuenciación de próxima generación utilizando altas concentraciones de ADN.

No se requiere ATP porque la polinucleótido quinasa T4 puede utilizar los desoxirribonucleótidos (dATP y dTTP) utilizados en la mezcla de reacción de embotamiento como donantes de fosfato.

Las mezclas de enzimas se suministran en 100 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1% Triton X-100, 50% glicerol; pH 7,4 a 25 °C.

Las mezclas de enzimas se suministran con 1 mM de dNTP (N2060) y tampón de reparación de extremos 10X (B9140) que contiene 1 M Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 mM MgCl 2 , 50 mM DTT, 0,25 % Triton X-100; pH 7,5 a 25 °C.

Actuación

Prueba: Especificación
Pureza: >99%
Nucleasa 3'→5': funcional
Fosforilación 5': funcional
Síntesis de ADN 5'→3': funcional
Endonucleasa bicatenaria: 10 µL = Sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 10 µL <10 copias

Principio

La mezcla de reparación de extremos produce ADN romo fosforilado en 5' mediante la reparación de ADN con extremos 5' protuberantes y/o 3' protuberantes dañados o incompatibles. La conversión a ADN romo se logra aprovechando las actividades de la polimerasa 5'→3' y la exonucleasa 3'→5' de la ADN polimerasa T4 (P7080). La acción de la polinucleótido quinasa T4 (Y9040) en la mezcla garantiza que los extremos de los fragmentos de ADN romos se fosforilen en 5' para su posterior ligación. El ADN con los extremos reparados puede ligarse de forma rápida y eficiente en plásmidos, cósmidos, fósmidos, BAC, otros vectores de clonación o adaptadores de secuenciación de ADN de nueva generación.

Procedimiento

Las instrucciones para utilizar End-Repair Mix (concentración alta y baja) se proporcionan en el protocolo del kit correspondiente en los recursos a continuación.

Control de calidad

Las enzimas purificadas de la mezcla de reparación terminal (ADN polimerasa T4 P7040 y polinucleótido quinasa T4 Y9040) están libres de endonucleasas contaminantes. Además, se analizó una pureza enzimática superior al 99 % mediante SDS-PAGE. Se confirmó la presencia insignificante de ADN genómico de E. coli mediante qPCR.

En un ensayo funcional, se añadieron 2 μL de la mezcla de reparación de extremos a un ADN plasmídico desfosforilado y digerido con enzimas de restricción doble en un tampón de reacción 1X con 0,1 mM de dNTP, y se incubó a 25 °C durante 30 minutos. Las células competentes se transformaron con la mezcla de ligación, se sembraron en placas LB/Amp/X-Gal y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se analizaron en paralelo reacciones de control, consistentes en la mezcla de reparación de extremos sin ADN polimerasa T4 ni polinucleótido quinasa T4. La eficiencia de la reacción se evaluó comparando el número de colonias azules y blancas presentes en las placas de la mezcla de reparación de extremos con el de las placas de control.

Aplicaciones

- Preparación de ADN genómico cortado o digerido con enzimas de restricción para la ligadura de adaptadores de secuenciación de ADN de próxima generación
- Preparación de ADNc bicatenario, producido a partir de transcripciones de ARN celular, para la ligadura de adaptadores de secuenciación de ADN de próxima generación
- Preparación de ADN cortado o digerido para ligadura de extremos romos en vectores de plásmidos, cósmidos, fósmidos o BAC
- Preparación de ADN amplificado por PCR, que contiene protuberancias A, para una clonación de extremos romos eficiente y rentable

Estos productos están disponibles para aplicaciones de biología molecular como: