Qiagen, Y9180L, sistema de escisión de uracilo (10x)

Sistema de escisión de uracilo, que incluye endonucleasa VIII (0,375 mL) y uracilo-ADN glicosilasa (0,375 mL).

Características

- Sistema de dos enzimas, uracilo ADN glicosilasa (UDG) y endonucleasa VIII
- UDG cataliza la escisión de la base de uracilo, creando un sitio abásico con una cadena principal de fosfodiéster intacta.
- La endonucleasa VIII rompe la cadena principal fosfodiéster tanto en 3' como en 5' hasta el sitio abásico, liberando el azúcar desoxirribosa.

Detalles del producto

El sistema de escisión del uracilo proporciona dos enzimas que, al añadirse secuencialmente a una reacción que contiene un fragmento de ADN sintético con desoxiuracilo, generan un único nucleótido hueco en la ubicación del residuo de uracilo. Los dos componentes enzimáticos individuales, la uracilo ADN glicosilasa y la endonucleasa VIII, proporcionados a una concentración 10x, se añaden a una reacción que contiene una secuencia de polinucleótidos con uracilo. La UDG cataliza la escisión de la base de uracilo, creando un sitio abásico con una cadena principal de fosfodiéster intacta (1-2). La actividad liasa de la endonucleasa VIII rompe la cadena principal de fosfodiéster, tanto 3ʹ como 5ʹ, al sitio abásico, liberando el azúcar desoxirribosa (3-4).

UDG se suministra en 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA y 50% glicerol; pH 7,5 a 25 °C.

La endonucleasa VIII se suministra en 10 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0,1 mM EDTA y 50% glicerol; pH 8,0 a 25 °C.

Actuación

Prueba: Cantidad analizada
Pureza: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 10 μL
Exonucleasa bicatenaria: 10 μL
Endonucleasa bicatenaria: 10 μL
Contaminación de ADN de E. coli: 5 μL

Principio

Las proteínas se producen y purifican por separado a partir de cepas de E. coli que contienen genes recombinantes de endonucleasa VIII y uracil-ADN glicosilasa.

Una unidad de UDG se define como la cantidad de enzima que cataliza la liberación de 1,8 nmol de uracilo en 30 minutos a partir de ADN bicatenario, tritiado y que contiene uracilo a 37 °C en tampón de reacción UDG 1x.

Una unidad de endonucleasa VIII se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir 1 pmol de un dúplex de oligonucleótidos que contiene un único sitio AP en 1 hora a 37 °C.

Procedimiento

Instrucciones de uso

El volumen se puede ajustar para adaptarse a los requisitos de la aplicación manteniendo las proporciones de los componentes que se describen a continuación para una reacción de 10 µL.

1. Prepare el ADN con uracilo (p. ej., producto de amplificación por PCR). Las enzimas del sistema de escisión de uracilo son activas en la mayoría de los tampones de reacción de biología molecular, por lo que no es necesario cambiarlos antes de iniciar la reacción de escisión.

2. Agregue 0,5 µL de UDG (G5010L) a un recipiente de reacción que contenga el sustrato de ADN (concentración final de hasta 300 nM) en tampón de reacción 1x.

3. Agregue 0,5 µL de Endonucleasa VIII (Y9080L) a lo anterior.

4. Incubar a 37°C durante 30 minutos.

5. Tras el período de incubación, la reacción puede detenerse añadiendo una solución de parada de carga de gel como preparación para el análisis electroforético o para la transformación. En caso de transformación, el fragmento puede ligarse a un vector de clonación utilizando la ADN ligasa T4 (L6030-HC).

Control de calidad

La actividad específica de UDG se midió mediante un método de dilución seriada doble. La enzima se diluyó en tampón de reacción 1x y se añadió a reacciones de 50 µL que contenían tampón de reacción UDG 1x y un producto de PCR, un 3H-dUTP. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37 °C, se colocaron en hielo y se analizaron mediante un método de precipitación con TCA.

La actividad específica de la endonucleasa VIII se midió mediante un método de dilución seriada doble. Se realizaron diluciones de la enzima en un tampón de reacción 1x y se añadieron a reacciones de 10 µL que contenían 2,0 µM de un oligonucleótido dúplex de 34 bases marcado con FAM, que contenía un solo uracilo. El sustrato se pretrató durante 2 minutos con UDG para crear un sitio abásico. Las reacciones se incubaron durante 60 minutos a 37 °C, se colocaron en hielo, se desnaturalizaron con N-N-dimetilformamida y se analizaron en un gel de TBE-urea acrilamida al 15 %.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina para cada enzima por separado en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina para cada enzima por separado en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

Actividad de endonucleasa bicatenaria v en una reacción de 50 µl que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Clonación

- Lindhal, T., et al. (1977) J. Biol. Química. 252:3286.
- Lindhal, T. (1982) Annu. Rev. Bioquímica. 51:61.
- Melamede, RJ, et al. (1994) Bioquímica 33:1255.
-Jiang, D., et al. (1997) J. Biol. Química. 272:32230.

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias