Qiagen, Y9220L, ARNasa H (5000 U)

ARNasa H (1 mL a 5000 U/mL) y tampón de ARNasa 10X (2 x 1,5 mL)

Características

- Útil para eliminar ARNm durante la síntesis de ADNc de segunda cadena.
- Produce moléculas de ribonucleótidos con extremos 5'-fosfato y 3'-hidroxilo.

Detalles del producto

La ARNasa H (rnh) de E. coli es una endorribonucleasa que degrada la cadena de ARN de moléculas híbridas de ARN/ADN (1,2). La digestión con ARNasa H produce moléculas de ribonucleótidos con extremos 5'-fosfato y 3'-hidroxilo. La ARNasa H es prácticamente inactiva frente a moléculas de ARN monocatenarias o bicatenarias.

Se suministra en: 20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0,1 mM DTT, 10 mM MgCl 2 , 0,1 mM EDTA, 50 % glicerol (pH 7,9 a 25 °C)

Se suministra con: tampón de ARNasa H 10X (B9220): 500 mM Tris-HCl, 750 mM KCl, 30 mM MgCl2, 100 mM DTT (pH 8,3 a 25 °C)

Actuación

Prueba: Cantidad analizada
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 500 U
Exonucleasa bicatenaria: 500 U
Endonucleasa bicatenaria: 500 U
Contaminación por ADN de E. coli: 500 U
ARNasa no específica: 500 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 18,1 kDa

Principio

La enzima se purifica a partir de una cepa de E. coli recombinante que lleva el gen ARNasa H (rnh) de E. coli.

Una unidad se define como la cantidad de enzima que hidrolizará 1 nmol de ARN de una molécula híbrida de ADN:ARN marcada con 3 H en material soluble en ácido en 20 minutos a 37 °C.

Procedimiento

Componentes: Concentración final
Agua libre de nucleasas: N/A
Tampón de ARNasa H 10X (B9220): 1X
ARN: dúplex de ADN: 2 µg
ARNasa H (Y9220L): 5 U
Volumen total =: 100 µL

- Prepare la siguiente mezcla de reacción en un volumen total de 100 µL: Componentes Concentración final Volumen Agua libre de nucleasas N/AX µL Tampón 10X RNasa H (B9220) 1X 10 µL Dúplex ARN: ADN 2 µg X µL RNasa H (Y9220L) 5 U 1 µL Volumen total = 100 µL
- Incubar la reacción a 37°C durante 20 minutos.
- Detener la reacción añadiendo 1 µL de EDTA 0,5 M.

Instrucciones de uso

Control de calidad

La actividad unitaria se mide mediante un método de dilución seriada doble. Las diluciones de la enzima se realizaron en tampón de reacción de ARNasa H 1X y se añadieron a reacciones de 50 µL que contenían poli(rA) marcado con 3H, poli(dT)ADN y tampón de ARNasa H 1X. Las reacciones se incubaron durante 20 minutos a 37 °C, se sumergieron en hielo y se analizó la liberación de los recuentos solubles de TCA.

La concentración de proteína (OD 280) se determina mediante la absorbancia de OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de la detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación del ADNr 16S de E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

La contaminación por ARNasa no específica se evalúa utilizando el kit RNase Alert (Integrated DNA Technologies), siguiendo las pautas del fabricante.

Aplicaciones

- RT-PCR
- síntesis de ADNc
- RT-qPCR

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias

1. Donnis-Keller, H. (1979) Nucl. Acids Res., 7, 179. 2. Schultz, SJ y Champoux, JJ (2008) Virus Res., 134(1-2): 86-103.