Product Description
20.000 U de inhibidor de ARNasa (0,5 mL a 40.000 U/mL). Temperatura de almacenamiento: –25 °C a –15 °C.
Características
- Inhibidor no competitivo de las ribonucleasas de tipo pancreático, por ejemplo, las ARNasas A, B y C
- Proteína ácida de 52 kDa que se expresa de forma recombinante en E. coli que lleva el gen inhibidor de la ARNasa porcina.
- No inhibe otras ARNasas ni enzimas modificadoras como polimerasas y transcriptasas inversas.
Detalles del producto
El inhibidor de la ARNasa es una proteína ácida de 52 kDa que es un potente inhibidor no competitivo de las ribonucleasas de tipo pancreático, como la ARNasa A, la ARNasa B y la ARNasa C. La enzima se proporciona como una fusión del gen inhibidor de la ARNasa porcina con una etiqueta de proteína patentada de 22,5 kDa.
La enzima se suministra en 20 mM Hepes-KOH, 50 mM KCl, 8 mM DTT, 50% glicerol, pH 7,5 a 25 °C.
Actuación
Ensayo: Especificación
Pureza: >99%
Actividad específica: 53.333 U/mg
Exonucleasa monocatenaria: 2000 U: <5,0 % liberado
Exonucleasa bicatenaria: 2000 U: <1,0 % liberado
Endonucleasa bicatenaria: 2000 U; sin conversión
Contaminación por ADN de E. coli: 2000 U: <10 copias
Contaminación por ARNasa: 2000 U: No se detecta ARNasa no específica
Principio
La enzima inhibe específicamente las ARNasas A, B y C. Las inhibe mediante una unión no covalente en una proporción 1:1 con alta afinidad. No interfiere con la actividad de otras ARNasas ni de enzimas modificadoras como las polimerasas y las transcriptasas inversas.
Procedimiento
Las instrucciones para utilizar el inhibidor de ARNasa se proporcionan en el protocolo del kit correspondiente en los recursos a continuación.
Control de calidad
La actividad unitaria se determinó mediante el método de dilución seriada. Se realizaron diluciones de la enzima en tampón de reacción inhibidor de ARNasa 1X y se añadieron a reacciones de 1000 μL que contenían 1 mM de citidina 2',3'-monofosfato cíclico y 1 μg de ARNasa A en un tampón de reacción 1X con 100 mM de Tris-acetato y 1 mM de EDTA, pH 6,5. Se observó la absorbancia a 286 nm a intervalos de 20 segundos durante una reacción de 5 minutos.
La concentración de proteína se determinó utilizando una muestra de 2,0 μL de enzima analizada a una DO de 280 usando un espectrofotómetro nanodrop ND-1000 estandarizado con una muestra de BSA de 2,0 mg/mL y blanqueada con solución de almacenamiento de producto.
La pureza física se evaluó utilizando 2,0 μL de solución enzimática concentrada, cargada en un gel desnaturalizante de Tris-glicina SDS-PAGE al 4-20%, flanqueado por un marcador de peso molecular de amplio rango y 2,0 μL de una dilución 1:100 de la muestra. Tras la electroforesis, se tiñó el gel y se compararon las muestras para determinar la pureza física. Los criterios de aceptación para esta prueba exigen que la masa total de las bandas contaminantes en la muestra concentrada no supere la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida, lo que confirma una pureza superior al 99% de la muestra concentrada.
La exonucleasa monocatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 10 000 cpm de un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 5.000 cpm de un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37ºC.
La actividad de endonucleasa bicatenaria se determinó en una reacción de 50 μL que contenía 0,5 μg de ADN pBR322 y 10 μL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.
La contaminación por E. coli se evaluó utilizando muestras de 5 μL de solución enzimática que se desnaturalizaron y analizaron en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.
Aplicaciones
- Aislamiento y purificación de ARN
- síntesis de ADNc
- RT-PCR y RT-qPCR
- Transcripción y traducción in vitro
- Producción de anticuerpos monoclonales libres de ARNasa
La enzima se utiliza en aplicaciones donde la presencia de ARNasas puede suponer un riesgo para la calidad del ARN y los resultados experimentales:
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