Qiagen, Y9370L, pirofosfatasa termoestable (1250 U)

1250 U de pirofosfatasa termoestable (0,625 mL a 2000 U/mL)

Características

- Hidrólisis de pirofosfato inorgánico para producir ortofosfato
- Baja K m (5,4 µM)
- Activo a pH 7–9
- Temperatura óptima para la actividad a 75°C

Detalles del producto

La pirofosfatasa termoestable es una enzima recombinante de Sulfolobus acidocaldarius que cataliza la reacción dependiente de Mg₂₄ de P₂O₄₃ + H₂O → 2HPO₃₄. Presenta una K₁₃ baja (5,4 µM) para el pirofosfato, es activa entre pH 7 y 9, su temperatura óptima de actividad es de 75 °C y es funcional en condiciones de PCR (1-3).

Se suministra en: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50 % glicerol (pH 7,5 a 25 °C)

Actuación

Prueba: Cantidad analizada
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 50 U
Exonucleasa bicatenaria: 50 U
Endonucleasa bicatenaria: 50 U
Contaminación por ADN de E. coli: 50 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 19,4 kDa

Principio

La proteína es producida por una cepa de E. coli que porta el gen de pirofosfatasa termoestable de S. acidocaldarius.

Una unidad es la cantidad de enzima que liberará 1 µmol de fosfato por minuto a partir de pirofosfato inorgánico a 75 °C y pH 8,5.

Procedimiento

Instrucciones de uso

La pirofosfatasa termoestable puede reducir los efectos inhibidores del PPi acumulado en las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) (5-7). Como punto de partida para la PCR, añada 0,01-0,1 U/µL de pirofosfatasa termoestable para identificar la concentración óptima. Notas: La catálisis de la pirofosfatasa termoestable depende del Mg₂₄. Por lo tanto, es importante tener Mg₂₄ en el tampón de reacción. Es compatible con la mayoría de los tampones de PCR que contienen Mg₂₄.

Control de calidad

Actividad de la unidad

El ensayo se basa en lo descrito por Taussky y Shorr (4). Brevemente, las diluciones de enzima se añaden a 30 mM Tris HCl pH 8,5, 1,5 mM MgCl 2 y 1,5 mM pirofosfato de sodio. Después de una incubación de 10 minutos a 75 °C, el producto formado, 2-ortofosfato, se hace reaccionar con molibdato de amonio para formar ácido fosfomolíbdico. El ácido fosfomolíbdico se reduce entonces por sulfato ferroso en condiciones de acidez débil para formar un color azul, cuya absorbancia se mide a 660 nm. La cantidad de producto formado se extrapola a partir de una curva estándar de fosfato generada a partir de la reacción de molibdato de amonio/sulfato ferroso. La concentración de proteína (DO 280 ) se determina por la absorbancia de DO 280. La pureza física se evalúa por SDS-PAGE de soluciones de enzima concentradas y diluidas seguida de detección de tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda de proteína de interés en la muestra diluida. La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática, incubada durante 4 horas a 37 °C. La exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática, incubada durante 4 horas a 37 °C. La endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C. La contaminación por ADNr 16S de E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática desnaturalizada y analizada en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores oligonucleotídicos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Producción de ortofosfato
- Evitar la inhibición en las reacciones de síntesis y modificación del ARN.
- Evitar la inhibición en las reacciones de PCR

- Leppänen, VM et al. (1999) Protein Sci., 8(6):1218-31.
- Hansen, T. y otros (1999) Arch. Biochem. Biophys., 363(1):135-47.
- Meyer, W. y otros (1995) Arch. Biochem. Biophys., 319(1):149-56.
- Taussky, HH y Shorr, E. (1953) J. Biol. Chem., junio;202(2):675-85.
- Moldes, C. et al. (2004) Aplica. Reinar. Microbiol., 70(8): 4642-4647.
- Dignam, JD y Deutscher, MP (1979) Bioquímica, 18(14):3165-70.
- Gibson, NJ y otros (1997) Anal. Biochem., 254(1):18-22.

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como:

Referencias