Qiagen, Y9380L, pirofosfatasa de E. coli (50 U)

50 U de pirofosfatasa de E. coli (0,5 mL a 100 U/mL)

Características

- Cataliza la hidrólisis de pirofosfato inorgánico (PPi) para formar ortofosfato.
- La eliminación de pirofosfato (PPi) y sus efectos inhibidores mejora las reacciones de síntesis de ARN y ADN.

Detalles del producto

La pirofosfatasa de E. coli cataliza la reacción dependiente de Mg de P 2 O 7 -4 + H 2 O → 2HPO 4 -2 .

Esta enzima se suministra en 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA y 50% glicerol.

Actuación

Prueba: Unidades probadas
Pureza: n/a
Actividad específica: n/a
Exonucleasa monocatenaria: 35 U
Exonucleasa bicatenaria: 35 U
Endonucleasa bicatenaria: 35 U
Contaminación por ADN de E. coli: 35 U

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C
- Peso molecular: 19.704 Daltons

Principio

La proteína enzimática recombinante es producida por una cepa recombinante de E. coli que porta el gen de la pirofosfatasa de E. coli. Una unidad es la cantidad de enzima que libera 1 µmol de fosfato por minuto a partir de pirofosfato inorgánico a 37 °C y pH 8,5.

Procedimiento

Instrucciones de uso

La pirofosfatasa de E. coli se utiliza ampliamente en la transcripción in vitro (IVT) o en reacciones de síntesis de ARN para reducir los efectos inhibidores del PPi. Como punto de partida para la reacción de síntesis de ARN in vitro, añada de 0,1 a 1 unidad por ml de pirofosfatasa de E. coli para determinar la concentración óptima.

Notas:

La catálisis de la pirofosfatasa de E. coli depende de Mg 2+, por lo tanto, es importante tener Mg 2+ en el tampón de reacción.

Referencias:

1. Lahti, R. y col. (1988) J. Bacteriol., 170(12), 5901-7.

2. Baykov, AA et al. (1996) Bioquímica, 35(15), 4655-61.

3. Taussky, HH y Shorr, E. (1953) J. Biol. Chem., 202(2), 675-85.

Control de calidad

Se añaden diluciones enzimáticas a 30 mM de Tris HCl (pH 8,5), 1,5 mM de MgCl₂ y 1,5 mM de pirofosfato de sodio. Tras una incubación de 10 minutos a 37 °C, el producto formado, 2-ortofosfato, reacciona con molibdato de amonio para formar ácido fosfomolíbdico. Posteriormente, el ácido fosfomolíbdico se reduce con sulfato ferroso en condiciones de acidez débil para obtener un color azul, cuya absorbancia se mide a 660 nm. El producto formado se extrapola a partir de una curva de fosfato estándar generada a partir de la reacción de molibdato de amonio/sulfato ferroso. El ensayo se basa en el descrito por Taussky y Shorr (3).

La concentración de proteínas se determina mediante la absorbancia OD 280.

La pureza física se evalúa mediante SDS-PAGE de soluciones enzimáticas concentradas y diluidas, seguida de detección mediante tinción de plata. La pureza se evalúa comparando la masa agregada de las bandas contaminantes en la muestra concentrada con la masa de la banda correspondiente a la proteína de interés en la muestra diluida.

La exonucleasa monocatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN monocatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la exonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene un sustrato de ADN bicatenario radiomarcado y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La actividad de la endonucleasa bicatenaria se determina en una reacción de 50 µL que contiene 0,5 µg de ADN plasmídico y 10 µL de solución enzimática incubada durante 4 horas a 37 °C.

La contaminación por E. coli se evalúa utilizando muestras replicadas de 5 µL de solución enzimática que se desnaturalizan y se analizan en un ensayo qPCR TaqMan para detectar la presencia de ADN genómico de E. coli contaminante utilizando cebadores de oligonucleótidos correspondientes al locus del ARNr 16S.

Aplicaciones

- Síntesis y modificación de ADN y ARN