Qiagen, Y9410L, mezcla de fragmentación WGS, 5x (24 reacciones) icono_0368_ls_gen_ecológico-s

Para 24 reacciones: Mezcla de fragmentación WGS 5x (1 x 0,24 mL), tampón de fragmentación 10X (1 x 0,25 mL) y potenciador (1 x 0,25 mL)

Características

- Alto rendimiento y sensibilidad de la biblioteca.
- Rango ajustable de tamaños de fragmentos
- Compatible con ADN de entrada de 1 ng – 1 µg
- Bibliotecas reproducibles
- Bajas tasas de duplicación y sesgo de distribución de base
- Uniformidad en una amplia gama de contenidos de GC

Detalles del producto

La Mezcla de Fragmentación WGS ofrece una solución de un solo tubo para la construcción de bibliotecas para plataformas Illumina. El protocolo permite la fragmentación, la reparación de extremos y la eliminación de colas de dA en un solo paso de reacción, lo que simplifica enormemente el flujo de trabajo y reduce el tiempo total de reacción y el tiempo de intervención.

La mezcla de fragmentación WGS se suministra con tampón de fragmentación 10X (n.° de cat. B0330) y potenciador (n.° de cat. B0340).

Actuación

- Flujo de trabajo más rápido con bibliotecas reproducibles de alta calidad
- Mayor rendimiento de la biblioteca y mejor sensibilidad con entradas de 100 ng y 100 pg
- Tamaños de fragmentos personalizables y fragmentación altamente reproducible
- Menor sesgo de distribución de base en la posición inicial
- Tasa de duplicación significativamente menor para entradas bajas de ADN
- Rendimiento desde cualquier entrada

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C

La cobertura del genoma de la mezcla de fragmentación WGS es comparable al corte mecánico con 100 ng y 1 ng de ADN.

La mezcla de fragmentación WGS proporciona:

Propiedades de la enzima:

Principio

- Utilizar buenas prácticas de laboratorio para minimizar la contaminación cruzada de productos de ácido nucleico.
- Utilice siempre tubos de PCR, tubos de microcentrífuga y puntas de pipeta que estén certificados como estériles y libres de DNasa y ARNasa.
- Antes de comenzar, limpie el área de trabajo y las pipetas con un producto de limpieza de ARNasa y ADN, como RNase Away (Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA).
- Para una amplificación consistente de la biblioteca, asegúrese de que el termociclador utilizado en este protocolo esté en buenas condiciones de funcionamiento y haya sido calibrado de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
Lea el protocolo completo antes de comenzar. Tome nota de los puntos de parada donde las muestras pueden congelarse a –20 °C y planifique su flujo de trabajo en consecuencia.
La fragmentación del ADN basada en enzimas es sensible a muchos factores, como la temperatura de reacción, el tiempo y las condiciones de configuración, así como al ADN de entrada. Recomendamos encarecidamente a los usuarios que practiquen el protocolo y optimicen el parámetro (tiempo de reacción) utilizando muestras de ADN iguales o similares.

Precauciones generales

Antes de empezar

Descongele los reactivos en hielo. Una vez descongelados, mezcle la mezcla enzimática de fragmentación 5X con movimientos suaves del dedo (no agite con vórtex) y mezcle los demás componentes con vórtex rápido para evitar concentraciones localizadas.

Procedimiento

Paso: Temperatura de incubación (°C)
1:4
2:32
3:65
4:4

ADN de entrada, ng: tamaño del pico del fragmento
250 pb: 350 pb
10:24
100:16
1000:14

Para >10 ng de ADN de entrada: Para 1–10 ng de ADN de entrada
Búfer de fragmentación 10X: 5
ADN purificado: X
Potenciador: 0
Agua libre de nucleasas: (35–X)
Volumen total: 40

- Antes de configurar la reacción, es fundamental determinar la cantidad de ADN de entrada, así como el tampón en el que se encuentra el ADN. Recomendamos encarecidamente que los usuarios practiquen este protocolo y optimicen el tiempo de reacción utilizando muestras de ADN iguales o similares.
Prepare el siguiente programa en un termociclador (tabla a continuación). Asegúrese de usar la tapa calefactada del instrumento y, si es posible, ajuste la temperatura a 70 °C. Cuando el bloque del termociclador alcance los 4 °C, pause el programa.

* Nota: El tiempo de reacción exacto podría requerir una optimización para diferentes cantidades de ADN de entrada. La tabla anterior sirve como guía general para determinar el punto de partida para optimizar el tiempo de reacción y lograr el tamaño de fragmento deseado. Para la optimización inicial, recomendamos incluir dos puntos de tiempo adicionales, uno 3 minutos más largo y otro 3 minutos más corto. Podría ser necesario un ajuste más preciso si el tamaño preciso del fragmento es crucial.

Para ADN de entrada ≤10 ng: para producir centros de tamaño de fragmento de alrededor de 350 pb, recomendamos agregar 2,5 µL de potenciador a una reacción de 50 µL e incubar durante 10 minutos.

3. Es importante seguir el procedimiento descrito a continuación para obtener resultados óptimos. El volumen final de la reacción es de 50 µl: utilice la tabla a continuación para configurar la reacción. Prepare una mezcla maestra en hielo combinando el tampón de fragmentación, el ADN y agua libre de nucleasas, como se indica en la tabla (los volúmenes corresponden a una muestra de ADN). Mezcle bien pipeteando suavemente (no agite con vórtex). La mezcla se puede ajustar según sea necesario para el número de muestras deseado (añada un 10 % de volumen adicional para compensar la pérdida de pipeteo al preparar la mezcla maestra para varias muestras).

4. Transfiera 10 µl de la mezcla de fragmentación 5X WGS a un tubo de PCR nuevo de pared delgada para cada reacción. Añada 40 µl de la mezcla maestra del paso 3 y mezcle bien con cuidado pipeteando de arriba a abajo de 10 a 12 veces. Es fundamental mantener el tubo de PCR en hielo durante toda la preparación de la reacción.

5. Centrifugue el tubo de muestra y transfiéralo inmediatamente al termociclador preenfriado (4 °C). Reanude el programa de ciclado.

6. Cuando el programa del termociclador se haya completado y el bloque de muestra haya vuelto a 4 °C, retire las muestras del bloque y colóquelas en hielo.

7. Proceda inmediatamente a la ligadura. Para lograr una eficiencia óptima de ligadura, recomendamos utilizar la ligasa WGS (n.° de cat. L6030-WL) y, si es necesario, la mezcla maestra HiFi PCR (n.° de cat. P7670).

Análisis de control de calidad

La funcionalidad de la mezcla de fragmentación 5X WGS se evalúa realizando la construcción de la biblioteca, PCR/qPCR y secuenciación.

Los componentes enzimáticos se analizaron antes del ensamblaje y se encontraron libres de endonucleasas y exonucleasas contaminantes. La pureza de la enzima fue >95%, según lo determinado por SDS-PAGE, y la contaminación insignificante del ADN genómico de E. coli se confirmó mediante qPCR.

Lotes específicos de la mezcla enzimática (n.° de cat. Y9410) y el tampón de fragmentación 10X (n.° de cat. B0330) se prueban y se comercializan juntos. No se garantiza su rendimiento si la enzima y el tampón se adquieren por separado.

Aplicaciones

- Preparación de la biblioteca NGS para Ilumina

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: