Qiagen, Y9420L, mezcla de enzimas de cola ER/A, 5x (24 reacciones)

Para 24 reacciones (paquete de evaluación): 5x mezcla de enzimas ER/A-Tailing (0,24 ml) y 10x tampón ERA (0,25 ml).

Características

- Combina la reparación de extremos y la eliminación de dA en un solo paso, para usar con ADN fragmentado
- Compatible con ADN de entrada de 250 pg a 1 µg
- Alta eficiencia y rendimiento de la biblioteca
- Bajas tasas de duplicación
- Uniformidad en una amplia gama de contenidos de GC
- Compatible con ADN de entrada que contiene EDTA

Detalles del producto

La mezcla enzimática de colas ER/A es un módulo de preparación de bibliotecas NGS. Este módulo utiliza una reacción de un solo paso que combina la reparación de extremos y la cola de dA para convertir el ADN fragmentado en fragmentos de ADN 5ʹ-fosforilados y 3ʹ-dA, lo que permite la ligación directa de adaptadores de secuenciación de Illumina. Al combinarse con el módulo de ligación WGS (n.° de cat. L6030-WL), la química optimizada garantiza una alta sensibilidad con un bajo aporte de ADN, una alta eficiencia de ligación para maximizar el rendimiento de la biblioteca y un flujo de trabajo de menos de 3 horas con menos de 45 minutos de tiempo de intervención.

La mezcla de enzimas de cola ER/A se suministra con tampón ERA 10x (n.° de cat. B9420).

Actuación

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C

Propiedades de las enzimas

Principio

La química y el protocolo optimizados proporcionan un flujo de trabajo optimizado que garantiza alta sensibilidad y eficiencia para una amplia gama de entradas de ADN, a la vez que maximiza el rendimiento de la biblioteca. La mezcla enzimática de cola ER/A ofrece una solución flexible para bibliotecas que garantiza calidad, velocidad y rendimiento, a la vez que es una opción rentable para operaciones de secuenciación de pequeña y gran escala.

Compatible con muestras de ADNg, ADNc y FFPE/FF

Procedimiento

Paso: Temperatura de incubación (°C)
1:4
2:20
3:65
4:4

Volumen para una reacción (µl)
Búfer de ERA 10X: 5
Muestra de ADN: X
Agua libre de nucleasas: (35–X)
Total: 40

Introduzca el siguiente programa en un termociclador (consulte la tabla a continuación). Asegúrese de utilizar la tapa calefactada del instrumento y, si es posible, ajuste la temperatura a 70 °C. Cuando el bloque del termociclador alcance los 4 °C, pause el programa. Compatible con entradas de ADN desde tan solo 250 pg y hasta 1 µg en agua, EB o 1X TE. Paso: Temperatura de incubación (°C) Tiempo de incubación (minutos): 1 4 1 2 20 30 3 65 30 4 4. Mantener.
Es importante seguir el procedimiento descrito a continuación para obtener resultados óptimos. Prepare la mezcla de reacción en un tubo de PCR nuevo de pared delgada en hielo, combinando el tampón ERA, la muestra de ADN y agua libre de nucleasas, como se indica en la tabla para cada muestra de ADN. Mezcle bien pipeteando suavemente (no agite con vórtex). El volumen final de la reacción es de 50 µl.

3. Añada 10 µl de la mezcla enzimática de cola ER/A 5X a cada reacción y mezcle bien con cuidado pipeteando de 6 a 8 veces. Se recomienda mantener el tubo de PCR en hielo durante toda la preparación de la reacción.

4. Centrifugue el tubo de muestra y transfiéralo inmediatamente al termociclador preenfriado (4 °C). Reanude el programa de ciclado.

5. Cuando se complete el programa del termociclador y el bloque de muestra haya regresado a 4 °C, retire las muestras del bloque y colóquelas en hielo.

6. Proceda directamente a la ligadura del adaptador. Recomendamos usar la ligasa WGS (n.º de cat. L6030-WL).

Análisis de control de calidad

Ensayo funcional de mezcla enzimática de cola ER/A: La longitud de la biblioteca de control de calidad (CC) debe ser inferior al 15 % de la longitud de la biblioteca de referencia. La concentración de la biblioteca de CC generada a partir de 100 ng de ADN de entrada (fragmentos de aproximadamente 300 pb en promedio) es >60 nm, con lecturas mapeadas >90 %. Para la biblioteca de CC, la cobertura normalizada debe estar entre 0,7 y 1,3 para la mayor parte del genoma (10-80 % de contenido de GC).

Los componentes enzimáticos se analizaron antes del ensamblaje y se comprobaron que estaban libres de endonucleasas y exonucleasas contaminantes. La pureza de la enzima fue >95%, según lo determinado por SDS-PAGE, y la contaminación insignificante del ADN genómico de E. coli se confirmó mediante qPCR.

Aplicaciones

- Preparación de la biblioteca NGS para plataformas Illumina

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: