Qiagen, Y9460L, ZipScript WarmX One-Step RT-qPCR Mix (250 reacciones)

Mezcla de enzimas ZipScript WarmX 10X (1 x 0,5 mL) y tampón de reacción ZipScript I 2X (2 x 1,5 mL)

Características

- Solución RT-qPCR altamente sensible, específica y reproducible
- Formulación eficiente de RT-qPCR multiplex de un solo paso
- ZipScript presenta una mezcla optimizada de EnzScript RT y Phoenix Hot Start DNA Polymerase
- ZipScript WarmX está formulado con una RTasa basada en aptámeros
- ZipScript WarmX reduce la transcripción inversa no específica durante la configuración de la reacción
- ZipScript WarmX es compatible con la automatización para la configuración de la temperatura ambiente

Detalles del producto

Los kits ZipScript One-Step RT-qPCR y ZipScript WarmX One-Step RT-qPCR son soluciones de RT-qPCR altamente sensibles y reproducibles, optimizadas para la PCR en tiempo real. Su formulación de qPCR multiplex dependiente de ARN de alta eficiencia permite una amplia gama de detección de muestras. ZipScript incorpora una combinación de transcriptasa inversa RNasa H-min (EnzScript Reverse Transcriptase) y una ADN polimerasa de inicio rápido (Phoenix Hot Start Taq DNA Polymerase). Para mayor comodidad operativa, detecte tan solo 0,1 pg de ARN en un ensayo de cuatro plexos con el formato de reacción de un solo paso. Además del rendimiento líder en el mercado de la RT-qPCR, la fabricación de primera clase de QIAGEN garantiza resultados consistentes y repetibles en su laboratorio.

El kit ZipScript WarmX One-Step RT-qPCR cuenta con un inicio en caliente basado en aptámeros que bloquea la transcripción inversa durante la configuración de la reacción a temperatura ambiente, lo que mejora la especificidad y la consistencia del ensayo. Las reacciones se pueden configurar a temperatura ambiente con mayor confianza, especialmente al utilizar soluciones automatizadas de alto rendimiento.

Se suministra con: 2X ZipScript Reaction Buffer 1 (B7641L) Consulte por opciones liofilizadas o listas para liofilizar.

Actuación

- Amplio rango de detección: alta sensibilidad (<0,1 pg de ARN humano total) combinada con un amplio rango de detección (>7 órdenes de magnitud).
- Multiplexación superior: Multiplex hasta 4 objetivos por reacción.
- Rendimiento líder en el mercado: sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y eficiencia superiores en comparación con las formulaciones líderes de la industria existentes.
- Rendimiento confiable: ideal para entornos de alto rendimiento donde la facilidad de uso, la compatibilidad de automatización y la precisión de los resultados son fundamentales.
- Respaldado por la calidad: la calidad de QIAGEN garantiza la consistencia de lote a lote, lo que reduce la variabilidad entre ensayos y maximiza la validez de los datos.

- Reduce la transcripción inversa no específica y espuria durante la configuración de la reacción a temperatura ambiente.
- Mantiene un rendimiento de ensayo robusto después de una preincubación prolongada (hasta 24 horas) a temperatura ambiente.
- Evita la pérdida de detección o menor amplitud resultante de la preincubación a temperatura ambiente.

- Temperatura de almacenamiento: –25°C a –15°C

ZipScript One-Step RT-qPCR Mix es una combinación de las enzimas EnzScript Reverse Transcriptase y Phoenix Hot Start Taq DNA Polymerase. EnzScript es una ADN polimerasa robusta, dependiente de ARN, sin actividad detectable de ARNasa H. Esta enzima permite generar ADNc de primera cadena a partir de ARNm o ARN total en un rango de temperatura óptimo de 42 a 50 °C.

La polimerasa Phoenix es una ADN polimerasa Taq recombinante termoestable complejada con un anticuerpo neutralizante termolábil. Esta capacidad de inicio rápido, mediada por anticuerpos y de activación rápida, mejora la especificidad, la sensibilidad y el rendimiento de la reacción de PCR al reducir la amplificación inespecífica y la formación de dímeros de cebadores antes del ciclado. Junto con EnzScript, Phoenix crea ZipScript, una mezcla de RT-qPCR extremadamente sensible con:

La transcriptasa inversa de inicio cálido basada en aptámeros presente en la mezcla 10X ZipScript WarmX One-Step RT-qPCR reduce la transcripción inversa inespecífica durante la configuración de la reacción a temperatura ambiente y mejora la especificidad y la consistencia del ensayo. La incorporación de la función WarmX facilita soluciones de automatización de alto rendimiento.

ZipScript WarmX:

Propiedades de la mezcla

Principio

ZipScript One-Step RT-qPCR Mix es una mezcla de enzimas EnzScript Reverse Transcriptase y Phoenix Hot Start Taq DNA Polymerase.

Las transcriptasas inversas polimerizan una cadena de ADN (ADNc) complementaria a una plantilla de ARN original. Posteriormente, el ADNc puede amplificarse mediante PCR y qPCR para el análisis posterior de las transcripciones y la expresión génica. La RT retroviral nativa presenta tres actividades bioquímicas secuenciales: actividad de la ADN polimerasa dependiente de ARN, actividad de la ribonucleasa H (ARNasa H) y actividad de la ADN polimerasa dependiente de ADN. En conjunto, estas actividades permiten a la enzima convertir el ARN monocatenario en ADNc bicatenario. La actividad de la ARNasa H degrada la cadena de ARN de un híbrido ADN/ARN y libera la nueva cadena de ADN para su uso como plantilla en la síntesis de la segunda cadena de ADN. La actividad de la ARNasa H se considera desventajosa para la síntesis de ADNc largos debido a su potencial para degradar la plantilla de ARN antes de completar la transcripción inversa completa.

La transcriptasa inversa EnzScript no presenta actividad detectable de ARNasa H y presenta mayor termoestabilidad. Esta enzima es adecuada para generar ADNc de primera cadena a partir de ARNm poli(A) o ARN total para su uso en aplicaciones posteriores como RT-PCR, clonación de ADNc o construcción de bibliotecas para secuenciación de ARN.

La ADN polimerasa Taq de inicio rápido Phoenix es una ADN polimerasa Taq recombinante termoestable, complejada con un anticuerpo neutralizante termoestable que bloquea la actividad de la polimerasa 5ʹ→3ʹ antes del paso inicial de desnaturalización del ADN de la PCR. Esta capacidad de inicio rápido mediada por anticuerpos mejora la especificidad, la sensibilidad y el rendimiento general de la PCR al reducir la amplificación inespecífica y la formación de dímeros de cebador antes del ciclo de PCR, y permite la comodidad de configurar la reacción a temperatura ambiente.

Para mejorar la especificidad y la consistencia del ensayo, especialmente en soluciones automatizadas de alto rendimiento, el kit ZipScript WarmX One-Step RT-qPCR incorpora una RTasa de inicio en caliente basada en aptámeros que bloquea la transcripción inversa durante la configuración de la reacción a temperatura ambiente. El procedimiento de inicio en caliente/caliente de dos fases garantiza un rendimiento de reacción robusto, lo que permite una configuración extensa de la reacción a temperatura ambiente con confianza.

Procedimiento

Componentes: Volumen por reacción
Agua libre de nucleasas: hasta un volumen de reacción final de 20 µL
2 tampones de reacción ZipScript I: 10 µL
50x ROX (opcional): 0,4 µL
Mezcla de cebadores y sondas: X µL
Mezcla de enzimas ZipScript 25x: 0,8 µL
Plantilla de ARN: variable

Pasos: Temperatura
Transcripción inversa: 50°C
Activación de Taq y desnaturalización inicial: 95 °C
Desnaturalización: 95°C
Recocido y extensión*: 60°C

Componentes: Volumen por reacción
Agua libre de nucleasas: hasta un volumen de reacción final de 20 µL
Tampón de reacción ZipScript 2X I: 10 µL
Mezcla de cebadores y sondas: X µL
Mezcla de enzimas WarmX ZipScript 10X: 2 µL
Plantilla de ARN: hasta 2 µL

Pasos: Temperatura (°C)
Transcripción inversa: 50
Activación de Taq y desnaturalización inicial: 95
Desnaturalización: 95
Recocido y extensión*: 60

- Todos los componentes y el montaje de la reacción deben mantenerse en hielo.
Descongele completamente el tampón de reacción ZipScript 2x I y agite en vórtex durante 3-5 segundos para mezclar bien. Si es necesario, centrifugue rápidamente para recoger el contenido.
Prepare la mezcla de cebadores y sondas. Se recomienda una concentración final de 0,4-0,9 µM para cada cebador y de 0,1-0,5 µM para la sonda. Sin embargo, la concentración óptima de cebadores y sondas debe determinarse empíricamente para cada ensayo.
- Determine el número de reacciones a preparar, incluyendo los controles sin plantilla (NTC). Añada un 10 % de volumen adicional para compensar la pérdida de pipeteo.
Utilice las cantidades indicadas en la tabla a continuación para preparar la mezcla de reacción. Recomendamos preparar una mezcla maestra para minimizar las variaciones y posibles errores. Componentes: Volumen por reacción. Concentración final: Agua libre de nucleasas. Para un volumen de reacción final de 20 µL: 2 tampones de reacción ZipScript I: 10 µL. 1x 50x ROX (opcional): 0,4 µL. 1x mezcla de cebadores y sondas: X µL. Variable. 25x mezcla de enzimas ZipScript: 0,8 µL. 1x plantilla de ARN: Variable. Variable.
- Selle la placa PCR y centrifugue brevemente para reducir los reactivos.
Programe las condiciones de ciclado según las recomendaciones a continuación. Pasos Temperatura Tiempo Ciclos Transcripción inversa 50 °C 15 minutos 1 Activación de Taq y desnaturalización inicial 95 °C 2 minutos 1 Desnaturalización 95 °C 15 segundos 40 Anexión y extensión* 60 °C 30-60 segundos * Los parámetros de ciclado se pueden modificar (especialmente los de annealing y extensión) para ajustarse a la selección específica de cebadores y sondas. Configuración de la reacción de RT-qPCR de un solo paso ZipScript WarmX

Configuración de la reacción RT-qPCR de un solo paso de ZipScript

1. Descongele completamente el tampón de reacción ZipScript 2X I y agítelo en vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclarlo bien. Si es necesario, remueva el contenido rápidamente.

2. Prepare la mezcla de cebadores y sondas. Se recomienda una concentración final de 0,4-0,9 µM para cada cebador y de 0,1-0,5 µM para la sonda. Sin embargo, la concentración óptima de cebadores y sondas debe determinarse empíricamente para cada ensayo.

3. Determine el número de reacciones a preparar, incluyendo los controles sin plantilla (NTC). Añada un 10 % de volumen adicional para compensar la pérdida de pipeteo.

4. Utilice las cantidades indicadas en la tabla a continuación para preparar la mezcla de reacción. Recomendamos preparar una mezcla maestra para minimizar las variaciones y posibles errores.

5. Selle la placa PCR y gire brevemente para reducir los reactivos.

6. Programe las condiciones de ciclismo según las recomendaciones siguientes.

* Los parámetros de ciclado se pueden modificar (especialmente los parámetros de annealing y extensión) para adaptarse a la selección específica de cebadores y sondas.

Análisis de control de calidad

La funcionalidad del ZipScript se evalúa mediante la amplificación de tres transcritos de ARNm en un ensayo RT-qPCR de un solo paso. El umbral de amplificación (Cq) del lote de prueba se compara con el de un lote de referencia.

La funcionalidad de ZipScript WarmX se evalúa mediante la amplificación de tres transcritos de ARNm en un ensayo RT-qPCR de un solo paso. El umbral de amplificación (Cq) del lote de prueba se compara con el de un lote de referencia.

Ensayo funcional del mecanismo de inicio en caliente. La función de inicio en caliente de ZipScript WarmX se prueba mediante amplificación por RT-qPCR basada en SYBR de un transcrito de ARNm tras una preincubación de 24 horas a 25 °C. El análisis de la curva de fusión confirmó que no se detectó amplificación inespecífica.

Los componentes enzimáticos se analizaron antes de la formulación de la mezcla maestra y se encontraron libres de endonucleasas y exonucleasas contaminantes. La pureza de la enzima fue >99%, según lo determinado por SDS-PAGE, y la contaminación insignificante por ADN genómico de E. coli se confirmó mediante qPCR. Se verificó la actividad específica de cada preformulación enzimática.

Aplicaciones

- RT-qPCR de un solo paso
- Análisis de la expresión génica de dianas de ARN
- Detección y cuantificación de ADN y ARN
- ZipScript WarmX es ideal para aplicaciones RT-qPCR de un solo paso con soluciones de automatización de alto rendimiento

Este producto está disponible para aplicaciones de biología molecular como: