Revvity, 62KB01REDC, ligando rojo de estaurosporina HTRF, 1 nmol

Descripción general
Este compuesto se deriva de la estaurosporina, un alcoide natural presente en Streptomyces Staurosporeus. Es un inhibidor prototípico de quinasas ATP-competitivas y ha demostrado ser altamente promiscuo, por lo que resulta muy útil para abordar múltiples quinasas en la plataforma de ensayo de unión a quinasas HTRF. El colorante fluorescente «d2» utilizado absorbe con su máximo cerca de 650 nm y fluoresce cerca de 670 nm. Es una molécula aceptora implementada en ensayos HTRF.
Los ensayos HTRF ofrecen muchas ventajas sobre otras tecnologías:

Formato homogéneo de adición y lectura
Sin pasos de lavado
Fondo bajo
Miniaturización sencilla desde microplacas de 96 o 384 pocillos a formatos de ensayo de alta densidad, como placas de 384 pocillos de bajo volumen y de 1536 pocillos.
Señal estable, que proporciona flexibilidad en el tiempo de lectura o tamaño de los ensayos.
Cómo funciona
Principio del ensayo de determinación de Kd
La unión de la Estaurosporina Roja se detecta mediante un ensayo sándwich utilizando el Anti-Tag marcado con criptato de europio (donador), que se une a la quinasa marcada, y un trazador fluorescente rojo marcado con d2 (aceptor). El principio de detección se basa en la tecnología HTRF. La relación HTRF (665/620) aumentará al añadir más trazador y se saturará en función de la constante de disociación (Kd) del trazador a la quinasa marcada. Para determinar si la Estaurosporina Roja es el trazador más adecuado para la quinasa marcada que le interesa, le recomendamos probar primero los kits de Descubrimiento de Unión a la Kinasa.

Protocolo de ensayo para la determinación de Kd
Los experimentos de unión de saturación de estaurosporina roja se pueden realizar en placas de 96 o 384 pocillos (volumen final de 20 µL).
En primer lugar, se prepara una serie de diluciones que oscilan entre 0 y 1 µM de estaurosporina roja en el tampón de unión a la quinasa en una placa de 96 pocillos sin unión.
A continuación, se añaden 5 µL de tampón de unión a quinasa a la placa final de 96 o 384 pocillos. A continuación, se añaden 5 µL de quinasa marcada, seguidos de 5 µL de Eu-criptato anti-etiqueta. Finalmente, se añaden 5 µL de la solución trazadora roja.
La relación HTRF se mide después de 1 hora de incubación.

Principio del ensayo de determinación de IC50/Ki
La unión de la estaurosporina roja se detecta mediante un ensayo sándwich utilizando un anticuerpo específico anti-GST, 6HIS o estreptavidina marcado con criptato de europio (donante), que se une a la quinasa marcada, y una estaurosporina roja fluorescente marcada con d2 (aceptor). El principio de detección se basa en la tecnología HTRF®. La proporción HTRF (665/620) aumentará con la adición de estaurosporina roja y se saturará en función de la constante de disociación (Kd) de la estaurosporina roja con respecto a la quinasa marcada. Al añadir un inhibidor de la quinasa, la estaurosporina roja se desplazará y la señal HTRF desaparecerá, dependiendo de la dosis.

Protocolo de ensayo para la determinación de IC50/Ki
Las evaluaciones farmacológicas de los inhibidores de interés se pueden realizar en placas de 96 o 384 pocillos.
Primero se prepara una dilución seriada del inhibidor entre 40 µM y 0,23 nM, y se dispensan 5 µL de cada concentración en la placa. A continuación, se añaden 5 µL de quinasa marcada, seguidos de 5 µL de Eu-criptato anti-marcador. Finalmente, se añaden 5 µL de solución de rojo de estaurosporina, preparada al cuádruple de la concentración final. La razón HTRF se mide tras 1 h de incubación.
Los análisis de los datos arrojan curvas dosis-respuesta típicas que oscilan entre 10 µM y 56 pM, lo que permite evaluar los valores de CI50/Ki del inhibidor de interés. Aplicación: Ensayo enzimático bioquímico.
Marca-HTRF
Modalidad de detección-HTRF
Grupo de productos: reactivo fluorescente
Condiciones de envío - Envío en hielo seco
Clase objetivo: quinasas
Tecnología-TR-FRET
Área terapéutica: Metabolismo/Diabetes, Neurociencia, Oncología e Inflamación
Tamaño de la unidad: 1 nmol