Revvity, 62KB02REDC, ligando rojo de dasatinib HTRF, 1 nmol

Descripción general
Este compuesto se deriva del dasatinib, un conocido inhibidor de las familias de quinasas BCR-ABL y SRC. El dasatinib, un inhibidor de quinasas competitivo con ATP, se utiliza como fármaco para tratar la leucemia mieloide crónica y la leucemia linfoblástica aguda. Se ha demostrado que se une con una afinidad <100 nM a aproximadamente el 16 % de las quinasas, principalmente a RTK. Por lo tanto, resulta útil para abordar múltiples quinasas en la plataforma de ensayo de unión a quinasas HTRF. El colorante fluorescente «d2» utilizado absorbe con su máximo cerca de 650 nm y fluoresce cerca de 670 nm. Se utiliza como molécula aceptora en ensayos HTRF.
Dasatinib-Red se suministra como una solución de 25 µM en DMSO.
Los ensayos HTRF ofrecen muchas ventajas sobre otras tecnologías:

Formato homogéneo de adición y lectura
Sin pasos de lavado
Fondo bajo
Miniaturización sencilla desde microplacas de 96 o 384 pocillos a formatos de ensayo de alta densidad, como placas de 384 pocillos de bajo volumen y de 1536 pocillos.
Señal estable, que proporciona flexibilidad en el tiempo de lectura o tamaño de los ensayos.
Cómo funciona
Determinación de Kd: principio del ensayo
La unión de Dasatinib-Red se detecta mediante un ensayo sándwich utilizando el Anti Tag marcado con criptato de europio (donador), que se une a la quinasa marcada, y un trazador fluorescente rojo marcado con d2 (aceptor). El principio de detección se basa en la tecnología HTRF. La relación HTRF (665/620) aumentará al añadir más trazador y se saturará en función de la constante de disociación (Kd) del trazador a la quinasa marcada. Para determinar si Dasatinib-Red es el trazador más adecuado para la quinasa marcada que le interesa, le recomendamos probar los kits de descubrimiento de unión a quinasas.

Protocolo de ensayo para la determinación de Kd
Los experimentos de unión de saturación de Dasatinib-Red pueden realizarse en placas de 96 o 384 pocillos (volumen final de 20 µL). Primero, se prepara una dilución seriada de entre 0 y 1 µM de Dasatinib-Red en el tampón de unión a quinasas en una placa de 96 pocillos sin unión. A continuación, se dispensan 5 µL de tampón de unión a quinasas en la placa final de 96 o 384 pocillos. A continuación, se añaden 5 µL de quinasa marcada, seguidos de 5 µL de Eu-criptato anti-etiqueta. Finalmente, se añaden 5 µL de la solución trazadora roja. La razón HTRF se mide después de 1 hora de incubación.

Principio del ensayo de determinación de IC50/Ki
La unión de Dasatinib-Red se detecta mediante un ensayo sándwich utilizando un anticuerpo específico anti-GST, 6HIS o estreptavidina marcado con criptato de europio (donante), que se une a la quinasa marcada, y un Dasatinib rojo fluorescente marcado con d2 (aceptor). El principio de detección se basa en la tecnología HTRF®. La proporción HTRF (665/620) aumentará al añadir más Dasatinib-Red y se saturará en función de la constante de disociación (Kd) de la estaurosporina-Red a la quinasa marcada. Al añadir un inhibidor de la quinasa, Dasatinib-Red se desplazará y la señal HTRF desaparecerá, dependiendo de la dosis.

Protocolo de ensayo para la determinación de IC50/Ki
La evaluación farmacológica de los inhibidores de interés se puede realizar en placas de 96 o 384 pocillos.
Primero, se prepara una dilución seriada de inhibidor entre 40 µM y 0,23 nM, dispensando 5 µL de cada concentración en la placa. A continuación, se añaden 5 µL de quinasa marcada, seguidos de 5 µL de Eu-criptato anti-marcador. Finalmente, se añaden 5 µL de solución de Dasatinib-Red, preparada al cuádruple de la concentración final. La razón HTRF se mide tras 1 h de incubación.
Los análisis de los datos arrojan curvas dosis-respuesta típicas que oscilan entre 10 µM y 56 pM, lo que permite evaluar los valores de CI50/Ki del inhibidor de interés. Aplicación: Ensayo enzimático bioquímico.
Marca-HTRF
Modalidad de detección-HTRF
Grupo de productos: reactivo fluorescente
Condiciones de envío - Envío en hielo seco
Clase objetivo: quinasas
Tecnología-TR-FRET
Área terapéutica: Metabolismo/Diabetes, Neurociencia, Oncología e Inflamación
Tamaño de la unidad: 1 nmol