Revvity, 62KB03REDE, ligando rojo de sunitinib HTRF, 20 nmoles

Descripción general
Este compuesto se deriva del sunitinib, un conocido inhibidor de las familias PDGF y VEGF RTK. El sunitinib, un inhibidor de quinasas competitivo con ATP, se utiliza como fármaco para tratar el carcinoma de células renales y los tumores del estroma gastrointestinal resistentes al imatinib. Se ha demostrado que se une con una afinidad <100 nM a aproximadamente el 18 % de las quinasas (tanto RTK como Ser/Thr). Por lo tanto, resulta útil para abordar múltiples quinasas en la plataforma de ensayo de unión a quinasas HTRF. El colorante fluorescente «d2» utilizado absorbe con su máximo cerca de 650 nm y fluoresce cerca de 670 nm. Se utiliza como molécula aceptora en ensayos HTRF.
Sunitinib-Red se suministra como una solución de 25 µM en DMSO.
Los ensayos HTRF ofrecen muchas ventajas sobre otras tecnologías:

Formato homogéneo de adición y lectura
Sin pasos de lavado
Fondo bajo
Miniaturización sencilla desde microplacas de 96 o 384 pocillos a formatos de ensayo de alta densidad, como placas de 384 pocillos de bajo volumen y de 1536 pocillos.
Señal estable, que proporciona flexibilidad en el tiempo de lectura o tamaño de los ensayos.
Cómo funciona
Principio del ensayo de determinación de Kd
La unión de Sunitinib-Red se detecta en un formato de ensayo sándwich utilizando el Anti Tag marcado con criptato de europio (donante), que se une a la quinasa marcada, y un trazador fluorescente rojo marcado con d2 (aceptor).
El principio de detección se basa en la tecnología HTRF®. La relación HTRF (665/620) aumentará al añadir más trazador y se saturará en función de la constante de disociación (Kd) del trazador a la quinasa marcada.
Para saber si Sunitinib-Red es el trazador más adecuado para la quinasa marcada que le interesa, le recomendamos que pruebe los kits Kinase Binding Discovery.

Protocolo de ensayo para la determinación de Kd
Los experimentos de unión de saturación de Sunitinib-Red se pueden realizar en placas de 96 o 384 pocillos (volumen final de 20 µL).
Primero, se prepara una dilución seriada de entre 0 y 1 µM de Sunitinib-Red en el tampón de unión a quinasas en una placa de 96 pocillos sin unión. A continuación, se dispensan 5 µL de tampón de unión a quinasas en la placa final de 96 o 384 pocillos. A continuación, se añaden 5 µL de quinasa marcada, seguidos de 5 µL de Eu-criptato anti-etiqueta. Finalmente, se añaden 5 µL de la solución trazadora roja.
La relación HTRF se mide después de 1 hora de incubación.
Principio del ensayo de determinación de IC50/Ki
La unión de Sunitinib-Red se detecta en un formato de ensayo sándwich utilizando un anticuerpo específico Anti-GST, 6HIS o estreptavidina marcado con criptato de europio (donante), que se une a la quinasa marcada, y un Sunitinib fluorescente rojo marcado con d2 (aceptor).
El principio de detección se basa en la tecnología HTRF®. La proporción HTRF (665/620) aumentará al añadir más Sunitinib-Red y se saturará en función de la constante de disociación (Kd) de Sunitinib-Red con la quinasa marcada.
Cuando se añade un inhibidor de la quinasa, Sunitinib-Red se desplazará y la señal HTRF desaparecerá, dependiendo de la dosis.

Protocolo de ensayo para la determinación de IC50/Ki
La evaluación farmacológica de los inhibidores de interés se puede realizar en placas de 96 o 384 pocillos.
Primero, se prepara una dilución seriada de inhibidor entre 40 µM y 0,23 nM, y se dispensan 5 µL de cada concentración en la placa. A continuación, se añaden 5 µL de quinasa marcada, seguidos de 5 µL de Eu-criptato anti-marcador. Finalmente, se añaden 5 µL de solución de Sunitinib-Red, preparada al cuádruple de la concentración final. La razón HTRF se mide tras 1 h de incubación.
Los análisis de los datos arrojan curvas dosis-respuesta típicas que oscilan entre 10 µM y 56 pM, lo que permite evaluar los valores de CI50/Ki del inhibidor de interés. Aplicación: Ensayo enzimático bioquímico.
Marca-HTRF
Modalidad de detección-HTRF
Grupo de productos: reactivo fluorescente
Condiciones de envío - Envío en hielo seco
Clase objetivo: quinasas
Tecnología-TR-FRET
Área terapéutica: Metabolismo/Diabetes, Neurociencia, Oncología e Inflamación
Tamaño de la unidad: 20 nmol