Revvity, 62KBD03PEA, kit de descubrimiento de HTRF quinasa-estreptavidina

Descripción general
El inhibidor de quinasas más conocido, Gleevec (imatinib), se une a una forma no activada de Abl. Por lo tanto, estos inhibidores son más difíciles de detectar mediante ensayos basados ​​en la actividad, por lo que conviene realizar ensayos de unión de quinasas para la quinasa de interés a fin de evitar la omisión de estos compuestos.
Además, los ensayos de unión de la quinasa HTRF® se configuran fácilmente, utilizando un formato de detección de mezcla y medición en ausencia de ATP.
Se mide el desplazamiento directo del inhibidor fluorescente desde el bolsillo de unión de ATP, lo que permite determinar la afinidad del inhibidor mediante la realización de curvas de respuesta a la dosis.
La preparación de quinasas purificadas es menos crítica en comparación con los ensayos enzimáticos, ya que las mediciones se pueden realizar en quinasas que tienen poca o ninguna actividad.
Cómo funciona
Principio del ensayo del kit de descubrimiento de quinasa-biotina
La unión de los trazadores se detecta en un formato de ensayo sándwich utilizando una estreptavidina específica marcada con criptato de europio (donante), que se une a la quinasa biotinilada N-terminal, y un trazador fluorescente rojo marcado con d2 (aceptor). La relación HTRF (665/620) aumentará al añadir más trazador y se saturará dependiendo de la constante de disociación (Kd) del trazador a la quinasa biotinilada N-terminal. El kit de descubrimiento de unión de quinasa-biotina ayuda a determinar qué trazador podría ser el más adecuado para configurar un ensayo de unión. El trazador con las mejores propiedades de ensayo (dependiendo de la Kd y la ventana de ensayo generada) se elegirá para realizar ensayos de unión competitivos.

Protocolo de ensayo del kit de descubrimiento de quinasa-biotina
Los experimentos de unión de saturación con los tres trazadores (es decir, rojo de estaurosporina, rojo de dasatinib y rojo de sunitinib) pueden realizarse en placas de 96 o 384 pocillos (volumen final de 20 µL). Primero, se prepara una dilución seriada del trazador entre 0 y 1 µM en el tampón de unión a quinasas en una placa de 96 pocillos sin unión. A continuación, se dispensan 5 µL de tampón de unión a quinasas en la placa final de 96 o 384 pocillos. A continuación, se añaden 5 µL de quinasa biotinilada N-terminal, seguidos de 5 µL de eu-criptato de estreptavidina. Finalmente, se añaden 5 µL de la solución del trazador rojo. La razón HTRF se mide después de 1 h de incubación. Aplicación: Ensayo enzimático bioquímico.
Marca-HTRF
Modalidad de detección-HTRF
Kit de grupo de productos
Condiciones de envío - Envío en hielo seco
Clase objetivo: quinasas
Especie objetivo: humanos
Tecnología-TR-FRET
Área terapéutica: Metabolismo/Diabetes, Neurociencia, Oncología e Inflamación
Tamaño de la unidad: 1 unidad