Revvity, 62KBHISKAB, kit de unión de MAb HTRF anti-6HIS-Eu criptato quinasa, 20 000 puntos de ensayo

Descripción general
El anticuerpo monoclonal anti-6HIS-Eu criptato quinasa de unión es una IgG2a generada contra una proteína de fusión marcada con polihistidina y Eu. Se ha demostrado que reacciona con quinasas marcadas con 6HIS.
Este reactivo está diseñado para su uso en la plataforma bioquímica de unión a quinasa HTRF.
Los ensayos HTRF ofrecen muchas ventajas sobre otras tecnologías:

Formato homogéneo de adición y lectura
Sin pasos de lavado
Fondo bajo
Miniaturización sencilla desde microplacas de 96 o 384 pocillos a formatos de ensayo de alta densidad, como placas de 384 pocillos de bajo volumen y de 1536 pocillos.
Señal estable, que proporciona flexibilidad en el tiempo de lectura o tamaño de los ensayos.
Cómo funciona
Principio del ensayo de determinación de Kd
La unión de los trazadores se detecta mediante un ensayo sándwich utilizando el anticuerpo anti-6HIS marcado con criptato de europio (donante), que se une a la quinasa marcada con 6HIS, y un trazador fluorescente rojo marcado con d2 (aceptor). El principio de detección se basa en la tecnología HTRF®. La relación HTRF (665/620) aumentará al añadir más trazador y se saturará en función de la constante de disociación (Kd) del trazador a la quinasa marcada con 6HIS.

Protocolo de ensayo para la determinación de Kd
Los experimentos de unión de saturación con los tres trazadores (es decir, rojo de estaurosporina, rojo de dasatinib y rojo de sunitinib) pueden realizarse en placas de 96 o 384 pocillos (volumen final de 20 µL). Primero, se prepara una dilución seriada del trazador entre 0 y 1 µM en el tampón de unión a quinasas en una placa de 96 pocillos sin unión. A continuación, se dispensan 5 µL de tampón de unión a quinasas en la placa final de 96 o 384 pocillos. A continuación, se añaden 5 µL de quinasa marcada con 6HIS, seguidos de 5 µL de Eu-criptato anti-6HIS. Finalmente, se añaden 5 µL de la solución del trazador rojo. La razón HTRF se mide después de 1 hora de incubación.

Principio del ensayo de determinación de IC50/Ki
Principio del ensayo de unión de la quinasa HTRF® (determinación de CI50/Ki). La unión de los trazadores se detecta mediante un ensayo sándwich utilizando el anti-6HIS marcado con criptato de europio (donador), que se une a la quinasa marcada, y un trazador fluorescente rojo marcado con d2 (aceptor). El principio de detección se basa en la tecnología HTRF®. La relación HTRF (665/620) aumentará al añadir más trazador y se saturará en función de la constante de disociación (Kd) del trazador a la quinasa marcada. Al añadir un inhibidor de la quinasa, el trazador se desplazará y la señal HTRF desaparecerá, dependiendo de la dosis.

Protocolo de ensayo para la determinación de IC50/Ki
La evaluación farmacológica de los inhibidores de interés puede realizarse en placas de 96 o 384 pocillos. Primero, se prepara una dilución seriada de inhibidor entre 40 µM y 0,23 nM, y se dispensan 5 µL de cada concentración en la placa. A continuación, se añaden 5 µL de quinasa marcada, seguidos de 5 µL de criptato de Eu anti-6HIS. Finalmente, se añaden 5 µL de solución trazadora, preparada al cuádruple de la concentración final. La razón HTRF se mide tras 1 h de incubación. Los análisis de los datos arrojan curvas dosis-respuesta típicas que oscilan entre 10 µM y 56 pM, lo que permite evaluar los valores de CI50/Ki del inhibidor de interés. Aplicación: Ensayo enzimático bioquímico.
Marca-HTRF
Modalidad de detección-HTRF
Grupo de productos: reactivo fluorescente
Volumen de muestra: 5 µL
Condiciones de envío - Envío en hielo seco
Clase objetivo: quinasas
Tecnología-TR-FRET
Área terapéutica: Metabolismo/Diabetes, Neurociencia, Oncología e Inflamación
Tamaño de la unidad: 20.000 puntos de ensayo