Revvity, 62KBSAKAF, mAb Eu-conjugado de quinasa-estreptavidina HTRF, 1000 puntos de ensayo

Descripción general
La estreptavidina se marcó con criptato de Eu. La biotina se une a la estreptavidina con alta afinidad (Ka = 10^15 M⁻). Esta unión es rápida y estable, lo que la convierte en una opción ideal para su uso en la plataforma bioquímica de unión a quinasas HTRF.
Los ensayos HTRF ofrecen muchas ventajas sobre otras tecnologías:

Formato homogéneo de adición y lectura
Sin pasos de lavado
Fondo bajo
Miniaturización sencilla desde microplacas de 96 o 384 pocillos a formatos de ensayo de alta densidad, como placas de 384 pocillos de bajo volumen y de 1536 pocillos.
Señal estable, que proporciona flexibilidad en el tiempo de lectura o tamaño de los ensayos.
Cómo funciona
Principio del ensayo de determinación de Kd
La unión de los trazadores se detecta mediante un ensayo sándwich con estreptavidina marcada con criptato de europio (donante), que se une a la quinasa biotinilada N-terminal, y un trazador fluorescente rojo marcado con d2 (aceptor). El principio de detección se basa en la tecnología HTRF®. La relación HTRF (665/620) aumentará al añadir más trazador y se saturará en función de la constante de disociación (Kd) del trazador a la quinasa biotinilada N-terminal.

Protocolo de ensayo para la determinación de Kd
Los experimentos de unión de saturación con los tres trazadores (es decir, rojo de estaurosporina, rojo de dasatinib y rojo de sunitinib) pueden realizarse en placas de 96 o 384 pocillos (volumen final de 20 µL). Primero, se prepara una dilución seriada del trazador entre 0 y 1 µM en el tampón de unión a quinasas en una placa de 96 pocillos sin unión. A continuación, se dispensan 5 µL de tampón de unión a quinasas en la placa final de 96 o 384 pocillos. A continuación, se añaden 5 µL de quinasa biotinilada N-terminal, seguidos de 5 µL de eu-criptato de estreptavidina. Finalmente, se añaden 5 µL de la solución del trazador rojo. La razón HTRF se mide después de 1 hora de incubación.

Principio del ensayo de determinación de IC50/Ki
Principio del ensayo de unión de quinasas HTRF® (determinación de CI50/Ki). La unión de los trazadores se detecta mediante un ensayo sándwich utilizando estreptavidina marcada con criptato de europio (donador), que se une a la quinasa marcada, y un trazador fluorescente rojo marcado con d2 (aceptor). El principio de detección se basa en la tecnología HTRF®. La relación HTRF (665/620) aumentará al añadir más trazador y se saturará en función de la constante de disociación (Kd) del trazador a la quinasa marcada. Al añadir un inhibidor de la quinasa, el trazador se desplazará y la señal HTRF desaparecerá, dependiendo de la dosis.

Protocolo de ensayo para la determinación de IC50/Ki
La evaluación farmacológica de los inhibidores de interés puede realizarse en placas de 96 o 384 pocillos. Primero, se prepara una dilución seriada del inhibidor entre 40 µM y 0,23 nM, y se dispensan 5 µL de cada concentración en la placa. A continuación, se añaden 5 µL de quinasa marcada, seguidos de 5 µL de Eu-criptato de estreptavidina. Finalmente, se añaden 5 µL de solución trazadora, preparada al cuádruple de la concentración final. La razón HTRF se mide tras 1 h de incubación. Los análisis de los datos arrojan curvas dosis-respuesta típicas entre 10 µM y 56 pM, lo que permite evaluar los valores de CI50/Ki del inhibidor de interés. Aplicación: Ensayo enzimático bioquímico.
Marca-HTRF
Modalidad de detección-HTRF
Grupo de productos: reactivo fluorescente
Condiciones de envío - Envío en hielo seco
Clase objetivo: quinasas
Tecnología-TR-FRET
Área terapéutica: Metabolismo/Diabetes, Neurociencia, Oncología e Inflamación
Tamaño de la unidad: 1000 puntos de ensayo